PGE2在人胚胎干细胞向造血细胞分化中的作用及其机制研究

人ES细胞是研究造血细胞发育的理想模型，也是获得大量血细胞的种子细胞来源。为阐明PGE2在人ES细胞向造血细胞发育过程中的作用及可能的调控机制，我们拟选用人ES细胞作为起始细胞。在人ES细胞向造血细胞分化的不同阶段，添加不同浓度的PGE2或环氧合酶抑制剂，通过流式细胞术、Western Blot、定量PCR等方法检测PGE2对不同分化阶段细胞的标志基因和蛋白表达的影响；并观察不同阶段细胞进一步向造血细胞分化的情况。结合PGE2受体的干涉表达、信号通路抑制剂的添加等实验进一步确定PGE2发挥作用的信号通路；利用荧光素酶报告系统分析、染色质免疫共沉淀等实验阐述PGE2通过激活下游信号通路进一步活化的靶基因（群）的情况。本研究将有助于阐明PGE2在造血细胞发育中的调控作用，更好地了解造血细胞的分化调控机制，为寻找高效诱导人ES细胞向造血细胞发育分化的方案提供新的依据。

目前人胚胎干细胞向造血干细胞诱导分化效率低，深入研究造血细胞发育分化的调控机制尤为迫切。为弄清前列腺素E2（PGE2）在人胚胎干细胞向造血细胞分化过程中的作用和调控机制，我们建立了分阶段诱导人胚胎干细胞向造血干细胞分化的模型，利用BMP4诱导人胚胎干细胞分化为中胚层祖细胞，随后利用VEGF和bFGF诱导中胚层祖细胞向生血内皮细胞分化，进一步利用SCF、IL-3、TPO、Flt-3L等细胞因子诱导获得造血干细胞，诱导获得的细胞表达造血干细胞表面标志蛋白CD34、CD45和CD117，高表达造血调控转录因子HoxB4、Runx1等基因，并具有造血集落形成能力。在此模型基础上，我们发现PGE2是人胚胎干细胞向造血细胞分化的重要调控因素。PGE2能够显著提高中胚层祖细胞、生血内皮细胞及造血细胞的分化效率。我们通过ELISA检测发现在人胚胎干细胞向早期中胚层祖细胞分化的过程中PGE2的合成水平呈现明显升高趋势，其关键性的合成限速酶COX-1的表达也明显提高。通过向诱导培养基中添加非甾体抗炎药吲哚美辛（Indo）抑制细胞内PGE2的合成，会阻断人胚胎干细胞向中胚层祖细胞的分化，进而导致细胞向早期神经外胚层的分化。进一步研究发现，阻断COX-1的酶活性或抑制其基因表达均会导致类似的现象，而阻断COX-2没有明显的变化。证明COX-1及其催化产物PGE2是决定人胚胎干细胞早期分化命运的关键调控因素。 .我们进一步研究发现，COX-1的转录水平受到了BMP4及其激活的Smad1/5/8信号通路的直接调控。添加BMP4信号通路抑制剂Dorsomorphin能够明显阻断BMP4对于COX-1基因的激活。BMP4激活的Smad蛋白复合体能够同COX-1启动子上游500bp-100bp之间一段SBE序列结合并启动COX-1基因的表达。过表达COX-1可诱导胚胎干细胞向中内胚层/中胚层祖细胞分化。PGE2通过EP2受体发挥对早期胚层细胞分化的调控作用。PGE2-EP2受体相互作用促进cAMP合成进而激活PKA，PKA通过调控GSK3β和β-catenin特定位点的磷酸化，促进β-catenin入核发挥对下游靶基因的转录调控作用。本课题的研究结果揭示了PGE2在人胚胎干细胞向中胚层祖细胞及造血细胞分化过程中的重要作用；为寻找高效诱导造血细胞分化的策略提供了新的理论依据。