基于砷响应蛋白ArsR无细胞生物传感器的构建与优化研究

Arsenic and its compounds are persistent toxic pollutants widely distributed in nature, and arsenic exposure can lead to a variety of diseases. Since permanently elimination of arsenic is difficult, the detection of arsenic contamination is critical. Bacterial whole-cell biosensor is a new detection technology developed in recent years. It is convenient, simple and sensitive. However, due to the interference of bacterial cell wall and cell membrane barrier, as well as the complex reaction of arsenic into the cell, the stability and sensitivity of the detection results are poor. In order to solve the above problems, in this study we intend to establish a biosensor in vitro to detect arsenic with a cell-free protein expression system complemented with the core components of arsenic response (ars operon /reporter gene). In order to achieve this goal, we will screen for the sensitive and suitable for in vitro expression ArsR mutants from the existing ArsR mutant library; Through the study of interaction of ArsR mutants with arsenic and DNA, derect the design and optimization of in vitro expression vector; Through the optimization of arsenic response operon in vitro expression, establish sensitive, rapid and convenient method for arsenic detection. The development of this study will provide a new technical means for the rapid and accurate detection of environmental pollutants, and will be helpful to the investigation and monitoring of arsenic emergencies and arsenic in the environment.

砷及其化合物是自然界广泛分布的持久性有毒污染物，砷暴露会导致多种疾病。由于砷难以永久性消除，砷的检测则极为重要。细菌生物传感器是近年发展起来的砷检测新技术，方便、简单且灵敏。但由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及砷进入胞内引起复杂的副反应的干扰，检测结果的稳定性、灵敏性较差。为了解决以上问题，本项目拟利用细菌生物传感器的核心组件：砷响应操纵子/报告基因，在无细胞体系中构建稳定性好灵敏度高的砷检测生物感受器。为了实现这一目标，我们从已有的ArsR突变体库中筛选对砷响应灵敏且适于体外表达的调控蛋白ArsR突变体；通过研究ArsR突变体与砷、DNA的相互作用，指导体外表达载体的设计和优化；通过优化砷响应操纵子体外调控报告基因的表达，建立高灵敏的、快速的、操作简便的砷检测生物传感器。该研究的开展，将为环境污染物的快速准确的检测提供新的技术手段，有利于砷突发事件及环境砷的调查和监控。

砷及其化合物是自然界广泛分布的持久性有毒污染物，砷暴露威胁人类健康。目前的技术无法永久性消除砷污染，因此，砷污染的监测和检测则极为重要。砷污染检测的传统方法依赖于大型的化学分析仪器，费时费力通量低，且需受过训练的专业人员在专门的实验室才能开展。全菌生物传感器是近年发展起来的砷检测新技术，方便、简单且灵敏。但由于细菌细胞壁和细胞膜屏障以及细菌个体代谢反应的干扰等问题，导致检测结果的稳定性较差。.为了解决全菌生物传感器的局限性，本研究利用全菌生物传感器的核心遗传编码组件：砷响应操纵子/报告基因，结合体外无细胞蛋白合成技术，构建无细胞砷生物传感器。主要研究成果如下：. 1、我们从已有的ArsR突变体库中筛选对砷响应灵敏且适于体外表达的突变体，野生型ArsR在体外对于砷响应不明显，筛选出的ep3 ArsR突变体在体外检测对50μg/L浓度的砷有明显响应，GPF荧光表达增强约3.4倍。. 2、检测到ep3 ArsR和GFP蛋白在体外均有表达，ArsR调控基因调节报告基因GFP的表达。. 3、研究了无细胞系统的组分提取和反应条件对无细胞砷生物传感器的性能的影响。结果发现最佳检测条件是37℃、pH7.2下平衡30 min后添加As2O3标准溶液诱导2 h，可以明显检测到GFP的表达水平上升。超声处理制备的源自E. coli Rosetta菌株的细胞提取物保持了较高的活性，利于无细胞蛋白合成系统在体外执行转录翻译的功能。. 4、研究了不同的报告基因和不同强度的RBS结合序列对无细胞砷生物传感器的性能的影响，发现无细胞系统中遗传回路的基本动力学不同于活细胞中的动力学，有效设计遗传编码的回路是无细胞蛋白合成系统与生物传感器技术结合的关键因素。. 5、完成初步优化的无细胞砷生物传感器，在0至50μg/L之间对于砷有良好线性响应，其检测限为3.65μg/L，小于中国目前对饮用水质量标准允许的砷浓度（10μg/L）。. 本研究建立无细胞砷生物传感器检测砷的方法，为实现砷的检测快速准确检测提供新思路，同时促进基于无细胞蛋白合成系统的生物传感器在实际环境毒性污染物检测中的应用。