化污生境来源纤维素酶的离子液体耐受性定向进化及结构-耐性关系研究

It is an advanced strategy to hydrolyze dissolved or porous cellulose in ionic liquid (IL) by cellulase. However, the deactivation of cellulase in IL restricts the industrial application of the strategy. Co-evolutionary mechanism plays important role in the process of enzyme’s adaptive variation. In view of the fact, a new strategy based on the synergic relationships between coevolving sites is proposed to evolve the IL stability property of cellulase, in which coevolving sites are taken as 'hot spots'. Before, we exploited a cellulase that can tolerance definite content of IL. The coevolution network of the cellulase will be drawn with the analysis of its family amino acid sequences. Focused mutant libraries at the coevolving site will be constructed and then notable mutants are screened using high-throughput screening method. The best beneficial mutant is taken as the template for next mutation toward neighboring coevolving site. Then the IL-tolerance property is improved step by step by iterative procedure. The physics and chemistry-driven artificial neural network is employed to extract the useful mutation information from all the above mutants, which are utilized to redesign mutants and construct the super IL-tolerance cellulase variant. The molecular dynamics simulation and spectrum technique are combined to contrast positive mutants and negative mutants. Thus the internal relevancy between the structure parameter and tolerance property is studied. The study can lay the theoretical foundation for the successful resolution of enzyme’s IL-tolerance mechanism.

离子液体可以直接溶解纤维素，因此在该类介质中对处于溶解或疏松态的纤维素进行酶解能够有效解除底物致密性对酶契合的阻碍，但纤维素酶在其中易失活是该策略工业化应用中的瓶颈问题。本项目以来源于化污生境且耐受离子液体的纤维素酶为典型材料，依据协同进化网络与酶环境稳定性间的关联性，选取协同进化位点为关键位点，旨在通过优化协同位点间的协作关系进一步拓展其离子液体耐性。拟靶向性地对协同位点饱和突变并筛选显著突变体，进而以正突变体为模板对相邻协同位点进行次轮突变，依次循环，迭代积累协同位点在维持离子液体耐性方面的协作效应；随后建立人工神经网络模型，理性指导正突变的叠加再进化，构建适用于高浓度离子液体体系的突变酶，并探索酶结构参数与耐性间的关联性。本研究有望开辟纤维素高效绿色转化的新途径，同时能为酶离子液体耐受机理解析提供理论支持。项目中新颖的进化思路也将为酶类耐热、耐盐等环境适应特性的改造提供方法学借鉴。

离子液体中纤维素均相酶解技术具有绿色高效的优势，利用稳定存在于高浓度离子液体体系的纤维素酶原位均相水解处于溶解态的纤维素，可以在减化预处理工序的同时突破纤维素的天然致密结构，从而实现酶与底物的多维契合与高效水解。然而，由于高浓度离子液体体系中纤维素酶易失活问题一直未得到理性解决，目前已报道体系均采用较低的离子液体浓度，导致纤维素无法大量的以溶解态或疏松态存在，实际时空转率无法满足工业生产要求。因此，能否有效保持纤维素酶水解活力是真正实现离子液体中纤维素高效、绿色转化的关键所在。. 本项目以来源于化污生境且耐受离子液体的纤维素酶为典型材料，依据协同进化网络与酶环境稳定性间的关联性，选取协同进化位点为关键位点，旨在通过优化协同位点间的协作关系进一步拓展其离子液体耐性。本项目通过传统的筛选方式从化学污染环境中获取一种离子液体耐受型纤维素酶，(1) 基于目标酶分子的肽链碎片序列测定，调取目标纤维素内切酶的编码基因；对目标纤维素内切酶的氨基酸序列进行数据库比对，结果表明该酶隶属糖基水解酶GH5 家族。在毕赤酵母表达系统中通过表达宿主及表达载体的筛选、结合进一步优化实现了目标酶的高效异源表达，酶活力达到218U/ml。(2) 采用MirrorTree 法提取蛋白分子的系统发育信号和熵驱动信号定位目标酶的协同进化位点，对目标序列的协同进化位点进行预测，呈现进化中位点间的协同关系，最终绘制了目标酶协同进化网络。（3）选取协同进化位点引入兼并密码子进行扩增，构建相应位点的饱和突变库；通过1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二甲酯为压力获得92个样本的离子液体耐受力高于60%，并且保持了野生型的活力的82%。（4）分析蛋白分子间关键参数，其中亲水性的氨基酸对水分子簇的聚合趋势及大小有显著的促进作用。本项目的完成为高效纤维素均相酶解体系的建立提供了稳定的突变酶；同时研究为酶类离子液体稳定性的改造及机理解析提供理论依据。本项目中独特的研究视角也能为酶类环境适应性相关特性的改造及优化提供参考与示范。