菜用大豆水通道蛋白抗逆功能及互作蛋白的研究

Aboitic stresses severely limit the productivity and quality of vegetable soybean. Aquaporins (AQPs) function as transmembrane channels for water and other small molecules during abiotic stress processes. The regulation mechanism of AQPs is complex. Current researches mostly focus on the transcriptional regulation mode of AQPs. However, researches on the posttranslational regulation of AQPs still lag behind the transcriptional regulation. To uncover the detailed regulation modes of AQPs under abiotic stresses from vegetable soybean, we firstly identify GmAQPs on the genomic level. Then we analyze the tissue-, environment- and hormone stimuli- specificity of GmAQPs by integrating the transcriptome sequencing and QRT-PCR data. In parallel, we identify the function of DNA element in the promoter of GmAQPs based on the activity of promoter: GUS as well as gene chip. Moreover, we explore the function of GmAQPs by overexpressing the candidate gene in both mutant and wild type plants. Then we investigate the physiology and molecular changes in transgenic plants compared to those in mutant and wild type plants. Finally, we screened out interaction partners of AQPs from cDNA library and detect the direct contact between AQPs and candidate proteins using methods of BiFC, pull down and co-precipitation. These results illuminate the regulatory mechanisms of AQPs from the gene, RNA and protein levels, which will provide gene resources and theory basis for vegetable soybean breeding program.

逆境胁迫是菜用大豆栽培中限制产量和品质的主要环境因素。水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)，形成多功能运输通道，介导胞内或胞间物质跨膜运输，参与逆境胁迫应答。AQPs调控机制错综复杂，目前研究多停留在转录水平，而对其蛋白活性调控的研究甚少。以此为出发点，本项目首先利用生物信息学技术对菜用大豆AQPs进行了全基因组特征分析；紧接着综合转录组测序和实时荧光定量PCR数据，分析AQPs时空表达特异性；同时结合基因芯片和启动子活性结果，开展AQPs上游DNA作用元件调控的研究；在此基础上，通过基因突变互补和超表达试验，结合生理和基因表达谱数据，对AQPs功能进行鉴定；最后，通过酵母双杂交系统初筛AQPs上下游蛋白，并进一步通过双分子荧光互补、体外蛋白结合及免疫共沉淀技术进行蛋白间互作验证。旨在从基因、转录和蛋白三水平，明确AQPs调控机理，从本质上为菜用大豆抗逆育种提供基因资源和理论依据。

水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）在植物逆境胁迫应答中发挥重要作用，本项目分别从基因、转录和蛋白三个水平研究了菜用大豆GmAQPs基因的抗逆功能及调控机理。从全基因组水平，共鉴定到75个GmAQPs。通过进化分析，发现GmAQPs划分为5个亚家族（24个GmPIPs、24个GmTIPs、17个GmNIPs、8个GmSIPs和2个GmXIPs）。通过qRT-PCR试验，筛选到2个GmAQPs（GmPIP2;6和GmTIP2;6）在根组织中明显应答干旱胁迫。通过启动子GUS融合试验，发现干旱等非生物胁迫能够诱导GmPIP2;6和GmTIP2;6启动子转基因拟南芥中GUS表达发生变化。通过基因过表达遗传转化野生型或突变型拟南芥植株，发现GmPIP2;6过表达能够显著提高转基因拟南芥的干旱胁迫耐受力和抗氧化酶活力，并引起多个非生物胁迫应答基因的表达变化。此外，进一步通过构建GmPIP2;6基因过表达和基因编辑载体，利用菜用大豆子叶节转化方法，以期获得GmPIP2;6耐旱菜用大豆材料并深入解析GmPIP2;6基因内在分子调控机理。通过亚细胞定位分析，发现GmPIP2;6蛋白定位在细胞膜上。通过酵母双杂交试验，发现CIPK蛋白激酶、高尔基体膜蛋白、泛素蛋白、抗病相关蛋白等能与GmPIP2;6发生蛋白间互作。通过双分子荧光互补试验，发现GmPIP2;6与GmCIPK蛋白互作发生在细胞膜上。同样，通过qRT-PCR和过表达遗传转化试验，发现GmCIPKs基因受多种非生物胁迫诱导表达，基因过表达能够提高转基因拟南芥的耐旱性。研究结果为从本质上理解菜用大豆GmAQPs抗逆分子调控机理以及改良作物抗逆性提供了基因资源和遗传材料以及理论依据。