Caldesmon调节血管平滑肌细胞参与血管内膜增生的机制研究

Vascular intimal hyperplasia diseases such as atherosclerosis and restenosis are characterized by inflammation-induced vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation and migration from media to intima which is closely related to cytoskeleton remodeling. Caldesmon (CaD), a actin binding protein which presents in nearly all vertebrate cells has significant regulation effect on cytoskeleton remodeling. Previous studies showed the expression and phosphorylation level of CaD had notable changes during vascular intimal hyperplasia diseases process, so CaD is considered as a potential marker for these kinds of diseases. But, the detailed regulatory mechanism of CaD on VSMC proliferation and mobility is still unknown with relatively few studies. In this proposal, we will test the hypothesis that CaD is a downstream substrate of ERK and PAK signaling pathways in VSMC upon cytokine and growth factors stimulation. The regulation effect of CaD expression and phosphorylation level on VSMC will be discussed intensively by well-organized experimental methods including siRNA to knock down CaD expression and overexpression of exogenous CaD with its phosphorylation mutants to disturb CaD phosphorylation cycling. Furthermore, CaD knockout mice model will be used to investigate the possible role of CaD in atherosclerosis process. By such studies, we propose to gain a new understanding of the molecular mechanism in vascular intimal hyperplasia diseases and provide rational experimental data for the consideration that CaD maybe a potential therapeutic target for vascular intimal hyperplasia diseases.

血管平滑肌细胞(VSMC)在炎性因子刺激下的增殖、迁移是血管内膜增生性疾病的重要环节，这都涉及到细胞骨架重塑。钙调蛋白结合蛋白(CaD)是一种普遍存在的肌动蛋白结合蛋白，能显著调节细胞骨架重塑。新近发现，CaD在血管内膜增生的VSMC中表达量和磷酸化程度均有明显变化，因此CaD被认为可能是伴随该类疾病的重要标志物，但CaD对VSMC增殖、迁移的调节机制尚不清楚，至今也鲜有报道。本项目在前期工作基础上，首先，利用siRNA抑制CaD表达；其次，高表达外源CaD及其磷酸化突变株，阻断或干扰CaD磷酸化循环，深入探讨CaD作为ERK、PAK磷酸化底物，在细胞和生长因子刺激下，其表达量和磷酸化程度对VSMC增殖、迁移的调节作用；最后，通过CaD基因敲除动物模型讨论CaD在动脉粥样硬化中的可能作用，为进一步认识血管内膜增生性疾病的分子机制，将CaD作为该类疾病潜在的治疗靶标提供新思路和相关实验佐证。

血管平滑肌细胞(VSMC)在炎性因子刺激下的增殖、迁移是血管内膜增生性疾病的重要环节，这都涉及到细胞骨架重塑。钙调蛋白结合蛋白(CaD)是一种普遍存在的肌动蛋白结合蛋白，能显著调节细胞骨架重塑。新近发现，CaD在血管内膜增生的VSMC中表达量和磷酸化程度均有明显变化，因此CaD被认为可能是伴随该类疾病的重要标志物，但CaD对VSMC增殖、迁移的调节机制尚不清楚，至今也鲜有报道。本项目在前期工作基础上，首先，利用siRNA抑制CaD表达，探讨内源CaD表达对VSMC细胞增殖、迁移活性的总体影响；其次，通过高表达外源CaD及其磷酸化突变株，阻断或干扰CaD磷酸化循环，深入探讨CaD作为ERK、PAK磷酸化底物，在细胞因子刺激下，其表达量和磷酸化程度对VSMC细胞株以及原代VSMC细胞增殖、迁移的调节作用；再次，通过CaD基因敲除动物模型讨论CaD在动脉粥样硬化中的可能作用；最后，通过体外合成模拟CaD磷酸化突变株的蛋白质多肽，将CaD作为血管内膜增生性疾病的靶标，讨论其潜在的临床治疗方法。本研究的结果显示，内源CaD基因沉默对VSMC细胞的增殖无显著影响但能够提高VSMC细胞的迁移能力；通过高表达外源CaD及其磷酸化突变株，阻断或干扰内源CaD磷酸化循环，能够显著抑制VSMC细胞株和原代VSMC细胞的增殖、迁移活性，但CaD在ERK和PAK位点的完全磷酸化突变株对VSMC细胞的增殖、迁移活性无显著影响；通过CaD基因敲除的小鼠模型，我们进一步发现，CaD基因缺失的小鼠，在高胆固醇饲养的条件下，内膜增生的能力与野生型小鼠相比，显著提高；根据以上实验结果，我们合成了CaD磷酸化突变的多肽，通过将多肽注入原代VSMC细胞，我们发现，模拟CaD磷酸化完全阻断的多肽能够显著抑制VSMC细胞的增殖、迁移能力。综上，本研究为进一步认识血管内膜增生性疾病的分子机制，将CaD作为该类疾病潜在的治疗靶标提供了新思路和相关实验佐证，通过合成CaD在ERK和PAK位点磷酸化封闭的蛋白质多肽可能是血管内膜增生性疾病治疗的一个潜在药物靶标。