RNA结合蛋白RBM47抗RNA病毒的作用及机制的研究

Recently, mosquito-borne viral diseases become worldwide threats to human health. Effective vaccines and antiviral drugs to most arboviruses, such as dengue virus (DENV), are not currently available. Through an RNAseq analysis, we have identified an RNA binding motif containing protein RBM47 that is induced upon DENV infection or interferon stimulation. Overexpression of RBM47 significantly restricts DENV replication. Co-immunoprecipitation experiments suggested that RBM47 binds to another RNA binding protein PCBP2. Based on these previous findings, we will further analyze the antiviral function and detail molecular mechanisms of RBM47 on RNA virus infection. Overexpression and gene knock down assay will be performed to explore the role of RBM47 in RNA virus infection. Immunofluorescence and RNA-protein co-precipitation will be used to study the potential binding of viral RNA to RBM47. Co-immunoprecipitation and RNA interference assay will be utilized to reveal the interaction between RBM47 and PCBP2, and further suggest the significance of this binding to the antiviral function of RBM47. For the first time, we identified that RBM47 is a novel Interferon-Stimulated Gene (ISG) and restricts RNA virus, such as DENV, infection. We will further analyze the detail mechanisms for the antiviral function of RBM47 and provide theoretical basis for the development of antiviral strategy related on RBM47 signaling.

近年来，虫媒病毒感染成为世界范围内的一个健康威胁。以登革病毒为代表的众多虫媒病毒仍未有安全有效的疫苗和抗病毒药物。通过RNAseq筛选，我们发现一个RNA结合蛋白RBM47在病毒感染或者干扰素刺激的情况下显著上调。过表达RBM47能够显著抑制登革病毒的复制。免疫共沉淀实验显示RBM47与另一个RNA结合蛋白PCBP2相互作用。基于这些发现，本项目将通过基因过表达和干扰技术研究RBM47与病毒感染的相互关系；用荧光共定位和RNA-蛋白共沉淀技术研究病毒RNA与RBM47的相互作用；用免疫共沉淀和RNA干扰技术验证RBM47与PCBP2的相互作用及其与RBM47抗病毒作用的相关性等。本项目首次发现了RBM47是一个干扰素诱导基因，并发挥抗登革病毒为代表的RNA病毒的作用。通过本项目的研究，将阐明RBM47抗RNA病毒的分子机制，并为开发针对RBM47及相关信号通路的抗病毒策略提供理论基础。

I型干扰素介导的免疫应答是宿主抵抗病毒入侵的第一道防线。干扰素结合到细胞表面的干扰素受体（IFNAR1/2）上，启动干扰素刺激基因的表达。维持IFNAR1 蛋白的稳定性对增强IFN-I 的抗病毒效果至关重要。.我们的前期试验通过高通量测序筛选发现了RBM47基因在登革病毒感染的细胞中表达上调。随后，我们又进一步验证了RBM47在细胞受到多种病毒感染或干扰素刺激后，表达显著上调。RBM47含有两个RNA结合结构域，可以特异性的结合RNA。研究表明，RBM47是胚胎发育和肿瘤发生过程中RNA转录后调控的关键蛋白，但目前尚没有相关研究报道RBM47在病毒感染的过程中有何作用。我们发现在细胞中过表达RBM47，能够有效抑制RNA 病毒VSV、DENV-2、ZIKV和H1N1以及DNA病毒 HSV-1的复制。而利用RNA干扰技术使该基因表达下调后，病毒的复制则显著增加。这提示RBM47在细胞中具有抗病毒作用。随后，我们还获得了RBM47基因敲除的杂合子小鼠，检测发现RBM47缺失的小鼠对VSV和HSV-1病毒感染都更加敏感，这说明RBM47在小鼠体内也具有抗病毒作用。.通过双荧光素酶报告基因实验检测到RBM47对病毒刺激的细胞中干扰素的表达没有显著影响，但是对I型干扰素下游活化原件ISRE的激活以及干扰素刺激基因ISGs的表达有显著增强的作用。蛋白-RNA共沉淀结合RNA测序发现，RBM47可以通过结合IFNAR1的mRNA的3’ UTR，增强该mRNA的稳定性，从而增强了细胞在IFN刺激后的抗病毒效应，促进了相关ISGs的正常表达。.为了解析RBM47相互作用的蛋白，我们利用免疫沉淀结合质谱分析方法(IP-MS)，发现了PCBP2与RBM47具有相互作用。PCBP2被报道是一个RNA结合蛋白，能够结合并稳定STAT1和STAT2的mRNA，促进ISGs的表达。基于RIP和QPCR分析，我们发现PCBP2可以协同RBM47稳定IFNAR1的mRNA，进而促进了ISGs的表达，增强了宿主抗病毒反应。.本课题首次揭示了RNA结合蛋白RBM47在增强宿主IFN下游信号通路的活化过程中发挥着重要作用。同时这也是首次发现RBM家族成员在抗病毒天然免疫调控中的作用，为抗病毒药物的研究提供了新的靶点。