双孢蘑菇酪氨酸酶基因表达的时空异质性分析及反义RNA抑制

酪氨酸酶（EC 1.14.18.1）是一种酚类物质氧化酶，在果蔬、菌类的酶促褐变中起关键作用。明确双孢蘑菇酪氨酸酶基因家族的遗传背景，应用生物技术抑制该酶酶活以防止褐变是重要的研究热点。本研究拟对双孢蘑菇不同发育阶段、不同子实体组织进行基于RT-PCR的同源克隆，获得不同酪氨酸酶基因的cDNA片段，通过3'-RACE和5'-RACE获得各基因全长cDNA，对其进行分子生物学特性分析和系统发育学分析，揭示双孢蘑菇基因家族内的异质性；根据所得不同基因的特异序列分别设计探针，与子实体的不同发育时期、同一子实体不同部位的RNA进行Northern杂交，将杂交信号的强弱信息与对应的酪氨酸酶酶活进行匹配性比较，分析不同编码序列转录的时空异质性，找到引起双孢蘑菇褐变的关键基因；进一步，构建反义基因表达载体，导入农杆菌后，以农杆菌转染双孢蘑菇，对转化子进行相关鉴定后，评价反义基因对酪氨酸酶基因的抑制效果。