克隆及功能分析拟南芥精细胞中磷酸化dTMP的激酶

Sperm cell in the mature pollen of Arabidopsis is in the S phase of cell cycle characterized by nuclear DNA replication.This event requires the participation of deoxyribonucleotides, one of which is dTTP. dTTP results from the phosphorylation of dTDP which is the production of dTMP phosphorylation catalyzed by thymidylate kinase.However, the known data reveal that Arabidopsis sperm cell does not express the critical thymidylate kinase gene. This indicates other kinase functions as the thymidylate kinase. Thus,our study will focus on the cloning of this gene and subsequent analysis of its functions about the nuclear DNA replication of sperm cell. We plan to employ the funtional complementation analysis with the yeast thymidylate kinase mutant to clone this gene, and perform a further survey about the effect of its knockout or knockdown on nuclear DNA replication of sperm cell. On the other hand, we also plan to investigate the effect of ectopic expression of the thymidylate kinase in sperm cell on its DNA replication. Our studies will reveal the identity of the critical kinase about the dTMP phosphorylation in sperm cell, and also contribute to the understanding why sperm cell uses this kinase to substitute the thymidylate kinase in dTDP synthesis.

拟南芥成熟花粉中的精细胞处于核基因组复制的S期，因而需要合成脱氧核糖核苷酸。脱氧核糖核苷酸之一的dTTP产生于dTDP的磷酸化，而dTDP则由胸苷酸激酶磷酸化dTMP所产生。然而，现有的研究结果表明：dTTP合成途径中的关键激酶- - 胸苷酸激酶在精细胞中并无表达。这表明其它激酶行使了它的功能。因此，本研究将克隆该基因并分析它在精细胞核基因组复制过程中的功能。我们将采用酵母缺失突变体功能互补分析的方法来克隆该基因，进而借助拟南芥突变体或者RNA干涉技术来分析它的敲除或者敲低对精细胞核基因组复制的影响；另一方面，我们还将分析胸苷酸激酶基因在精细胞中的异位表达是否会影响精细胞核基因组的正常复制。我们的研究结果将揭示精细胞中磷酸化dTMP 生成dTDP的关键激酶，并有助于理解精细胞为何要使用该激酶来替代胸苷酸激酶这一基本生物学问题。

成熟的拟南芥精细胞处于核DNA复制的S期，因而需要dTTP的参与。胸苷酸激酶磷酸化dTMP形成dTDP，是形成dTTP的关键酶。然而，该激酶在精细胞发育过程中却并不表达，提示其它蛋白替代了该酶的功能。通过分析拟南芥精细胞转录组，我们鉴定了两个激酶——腺苷酸激酶及核苷二磷酸激酶具有磷酸化dTMP的活力。它们的酶活力分别为胸苷酸激酶的15.4%和9.8%。我们用人工miRNA技术敲降了腺苷酸激酶在精细胞中的蛋白表达量，发现精细胞的发育并不出现异常，暗示核苷二磷酸激酶在产生dTTP的过程中也起着重要的作用。我们也调查了在精细胞中过表达胸苷酸激酶的情况，发现精细胞的发育及传导亦不出现异常。有意思的是，尽管胸苷酸激酶在拟南芥精细胞中不表达，但在具有大量线粒体DNA的黄瓜生殖细胞中却是表达的，这表明不同物种在雄性生殖系细胞中利用了不同的策略来合成dTTP。