芍药苷通过RIP1/RIP3/MLKL信号通路对糖尿病肾病足细胞损伤的保护作用及机制

Podocyte injury can led to the damage of filtration membrane, which is an important reason for the formation of proteinuria in the progress of diabetic nephropathy (DN). Programmed necrosis mediated by RIP1/RIP3/MLKL signal transduction is an important form of podocyte injury. Our previous results showed that the animal model of diabetes in podocyte fusion diffuse necrosis, paeoniflorin can directly bind to the active site of RIP1 to inhibit its activity, thereby reducing the programmed necrosis and inflammatory response, and the effect on the regulation of autophagy, but the mechanism is not yet clear. Therefore, we hypothesized that paeoniflorin may alleviate proteinuria by regulating RIP1/RIP3/MLKL signal transduction and increasing the autophagy and inhibiting the NF- kappa B pathway by reducing the programmed cell necrosis of the podocyte in the high glucose microenvironment. In this study, we aimed to construct the diabetic model of mice and cultured podocyte in vitro with high glucose, paeoniflorin and siRNA to systematically demonstrate the function of RIP1/RIP3/MLKL in the regulation of podocyte programmed necrosis and autophagy. This study will provide a new molecular target for the prevention and treatment of diabetic nephropathy, and provide experimental basis for the treatment of diabetic nephropathy.

足细胞损伤介导肾小球滤过屏障破坏在糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）蛋白尿发生中起重要作用，新近报道RIP1/RIP3/MLKL信号通路介导的程序性坏死作为足细胞损伤的一种重要形式。我们前期实验表明糖尿病模型中肾脏足细胞弥漫融合坏死，芍药苷可以直接结合RIP1的活性部位来抑制其活性，从而减轻程序性坏死及炎症应答，而且对自噬有调节作用，但机制尚未明确。我们假设芍药苷可能通过RIP1/RIP3/MLKL信号通路减轻高糖微环境下足细胞程序性坏死，上调自噬，抑制NF-kB通路进而抑制炎症应答，最终减轻DN蛋白尿。本项目拟用芍药苷体内外检测其是否减轻了肾脏足细胞的程序性坏死，且通过抑制RIP1检测自噬和程序性坏死通路的变化，探究芍药苷介导RIP1/RIP3/MLKL信号通路在DN足细胞损伤中起到关键作用，为DN防治提供新策略。

我国近年来糖尿病相关性肾病（diabetic kidney disease，DKD）发病率和患病率一直表现出上升趋势。DKD与以足细胞为主要成分的肾小球滤过屏障受损相关，足细胞一旦死亡，无法再生，而细胞自噬可以维持细胞稳态，避免细胞死亡，这提示调节自噬很可能是保护足细胞的治疗靶点之一。 芍药苷 (Paeoniflorin, PF) 是从经典草药芍药中提取的主要活性成分。 PF毒副作用低，对机体主要脏器具有广谱保护作用，在医学研究中受到了广泛关注。在急慢性肾脏疾病动物模型中，PF均表现出现明显的肾脏保护作用。我们课题组在前期研究中也发现PF可以改善糖尿病小鼠的尿白蛋白排泄和肾脏病理性改变，包括基底膜增厚，足突融合，系膜区增宽。但遗憾的是，研究焦点局限在肾间质的巨噬细胞中，而对于PF防治足细胞功能障碍，特别是在早期DKD的具体作用机制仍有待进一步地研究。.我们通过建立STZ诱导的糖尿病小鼠模型及高糖诱导的小鼠足细胞损伤模型，PF能改善体内外糖尿病肾病和高糖诱导的足细胞损伤，并上调足细胞自噬和抑制程序性坏死。接下来, 运用计算机对于芍药苷分子结构的分析以及SPR实验寻找并验证芍药苷对足细胞作用的靶标蛋白包括VEGFR2和TNFR1，并通过体外敲低靶标蛋白来验证芍药苷通过PF分别结合VEGFR2和TNFR1。紧接着运用计算机模拟及靶标蛋白敲除等实验方法验证芍药苷对足细胞上自噬和程序性坏死的作用靶点。因此，本研究表明，PF能通过结合VEGFR2和TNFR1蛋白分别影响下游的PI3K/AKT以及RIPK1/RIPK3/p-MLKL信号通路进而调控足细胞的自噬和程序性坏死。另外，通过生信分析，我们初步观察了DKD中肾小球上的铁死亡相关基因并进行初步验证。上述研究为今后DKD的发病机制提供了新的作用靶点，并为芍药苷治疗DKD提供了理论基础。