与新孢子虫蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的筛选和功能分析

Interactions between Neospora caninum proteins and host proteins are involved in N. caninum infection. N. caninum as intracellular parasites, they can survive and produce pathogenic though invade the host cells. Our previous study indicated that NcSRS2 and NcGRA7 antibody could inhibit the proliferation of N. caninum. However, it remains unclear how host proteins are playing their roles in this process. The NcSRS2, NcGRA7, NcAMA1 protein of N. caninum is responsible for mediating N. caninum entry into cells. This proposal aims to: (1) screening and identify the host proteins that exclusively interact with the NcSRS2, NcGRA7, NcAMA1 by GST pulldown, Yeast Two-hybrid System, co-immunoprecipitation and co-localization, and (2) investigate functional aspects of the identified cellular proteins in N.caninum infection by overexpression/knockdown, and antibody/soluble protein blocking assays. This project is expected to uncover the host cellular proteins and their regulatory roles, and provide scientific data for elucidating mechanisms, underlying the N.caninum invasion and development of potential therapies.

新孢子虫的感染通常和新孢子虫与宿主蛋白相互作用有关。新孢子虫作为细胞内寄生虫，需要入侵宿主细胞、在宿主细胞内复制才产生致病性。我们前期的研究发现NcSRS2和NcGRA7抗体可以抑制新孢子虫的增殖，但对于宿主细胞蛋白在这个过程扮演的作用并不清楚。鉴于新孢子虫NcSRS2、NcGRA7、NcAMA1蛋白与虫体感染宿主细胞相关，本研究拟利用GST pulldown、酵母双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦等技术筛选和鉴定与新孢子虫相互作用的宿主细胞蛋白，通过上调和下调表达，抗体封闭试验、可溶性蛋白阻断试验等研究宿主蛋白在新孢子虫入侵、复制过程中的作用。本项目有望揭示与新孢子虫蛋白相互作用的宿主蛋白及其调控作用，并为阐明新孢子虫感染宿主细胞的分子机制提供有价值的数据，为治疗药物的靶点研究提供更多的依据。

研究显示，宿主感染新孢子虫通常和新孢子虫与宿主蛋白相互作用有关。新孢子虫作为细胞内寄生虫，需要入侵宿主细胞、在宿主细胞内复制才产生致病性。因此，本研究主要内容是利用酵母双杂交等技术筛选和鉴定与新孢子虫相互作用的宿主细胞蛋白，并研究宿主蛋白在新孢子虫入侵、复制过程中的作用。项目的完成为阐明新孢子虫感染宿主细胞的分子机制提供有价值的数据，为治疗药物的靶点研究提供更多的依据。.我们的研究结果如下：.1、构建了带有His标签的蛋白表达载体：pET30a-NcSRS2、pET30a-NcGRA7、pET30a-NcAMA1，并在体外成功表达及纯化。.2、成功构建了NcAMA1、NcSRS2、NcGRA7酵母诱饵载体，鉴定了诱饵载体无自转录活性检测、对宿主菌无毒性，可用于酵母双杂交技术。通过诱饵载pGBKT7-NcAMA1筛选到了微丝蛋白A（filamin A）、跨膜蛋白TMED2、18S核糖体蛋白、线粒体蛋白；通过诱饵载体pGBKT7-NcSRS2筛选到了18S核糖体蛋白、微管蛋白结合蛋白（STMN2）、树突状细胞CD11受体蛋白、线粒体蛋白；通过诱饵载体pGBKT7-NcGRA7筛选到了热休克蛋白8（HSPA8）、寡聚糖转移酶蛋白（STT3B）、18S核糖体蛋白、NADH脱氢酶蛋白、线粒体蛋白。.3、在体外成功表达了筛选到的宿主细胞蛋白：STT3B、TMED2、STMN2及18S核糖体蛋白。并通过GST沉降实验，阐明了筛选蛋白与新孢子虫裂解蛋白相互作用，通过可溶性蛋白阻断试验，阐明了经过GST-STT3B阻断后，新孢子虫感染数有所下降。.4、通过特异性siRNA干扰下调宿主蛋白表达、用抗宿主细胞蛋白的抗体对细胞进行封闭，利用宿主蛋白慢病毒表达载体转入宿主细胞内过表达宿主细胞蛋白、将新孢子虫Nc1株与纯化的宿主细胞蛋白感作以及在Nc1非易感细胞（sf9）细胞分别过表达宿主细胞蛋白试验，阐明了筛选到的宿主细胞蛋白TMED2蛋白和STMN2蛋白在细胞中对Nc1感染中起到了抑制作用，18S核糖体蛋白对新孢子虫的感染无影响。