卵巢类器官三维模型建立及其在诱导脐带基质干细胞向生殖细胞分化中的作用及机制

生殖细胞再生是干细胞工程及生殖生物学研究的热点，本项目组前期研究发现脐带基质干细胞（UCMSCs）具有衍生女性生殖细胞的潜能，但尚未能获得功能性配子，推测可能与缺乏体内微环境或其他细胞因子等有关，结合类器官三维培养体系可更好的模拟体内微环境的研究报道，我们拟建立一个来自小鼠胚胎的"分散-重聚"卵巢类器官三维培养体系，将胚胎卵巢分散成单细胞，与UCMSCs细胞进行三维重聚培养，以期诱导卵母细胞生成。进而通过扫描电镜、免疫荧光、RT-PCR等方法观察重聚体内细胞结构和胞间连接，UCMSCs的生长发育，重建细胞基因重排、减数分裂等过程，探讨该模型在UCMSCs向生殖细胞分化中的作用及可能机制，为生殖细胞的再生研究提供基础。

本课题采用流式细胞仪、基因转染、激光共聚焦、免疫组化以及分子生物学等研究方法，对鼠原始生殖细胞和人脐带基质干细胞进行分散-重聚形成卵巢类器官体进行体外培养，和裸鼠体内移植研究，研究发现：1）将12.5dpc胎鼠性腺生殖细胞分散后与RFP HUCMSCs以3:1比例重聚成团，并进行培养，摸索卵巢类器官体模型，发现体外成团生长时间10h-2h最佳，并初步建立了胚胎卵巢分散-重聚共培养的卵巢类器官培养模型；2）设计建立了STO成纤维细胞饲养层、无血清培养基、去血清替代物(KO-SR)、Forskin、rhLIF、rhFGF、RA以及具生物活性的三维基质(Matrigel基质)以及Millipore细胞扩散小室等组成的卵巢类器官体细胞培养系统。共聚体经培养后进行SCP3、Stra8、DMC1等检测，证实可进入减数分裂过程，周边可见少许类似原始卵细胞样细胞生长。3）HuMSCs与原始生殖细胞共培养，结果显示OCT4、Stra8、VASA、SCP3及ZP3基因在PGCs表达明显，而在诱导分化后的HuMSC有少量表达。上述结果显示我们的卵巢类器官培养模型和培养条件已基本建立，原始生殖细胞生长环境对HuMSC有一定诱导向生殖细胞分化的作用。