维生素E琥珀酸酯通过CD47-SIRPα通路调节巨噬细胞吞噬促进抗肿瘤作用的机制研究

Vitamin E succinate（VES）, a derivative of vitamin E, has been shown to be a potent apoptosis inducer and growth inhibitor in a variety of cancer cells at levels at which it exerts no toxicity to normal cells ortissues. Our previous studies showed that exposure of human cervical cancer Hela cells to VES resulted in the decreases of CD47 at the mRNA and protein levels. Respecting the important role of CD47 in protecting cancer cells from being phagocytosed, these data suggest that VES has the potential for anticancer activity by immune mechanism. In the present study, human cervical cancer Hela cells will be treated with VES. To investigate whether VES affect phagocytic function of macrophages, a vitro phagocytosis assay will be performed using CFSE-labeled human cervical cancer Hela cells. In order to explore the possible mechanisms of action of VES in macrophages, phagocytosis associated molecules, MicroRNA profiles and MicroRNA targeting will be assessed. To elucidate the effect of VES on antigen cross-presentation capacity of macrophages, expression of MHC classes I and II and costimulatory molecules, cytokines levels, CD8+ T cell and CD4+ T cell activation will be detected. This study can bring innovation in exploring the anti-tumor mechanism of VES by immune response, and provide scientific basis for finding new scheme of cancer prevention and treatment.

维生素E琥珀酸酯（VES）是维生素E的衍生物，可有效抑制多种肿瘤细胞生长，对正常组织细胞无任何毒副作用。申请者前期工作表明VES明显降低人宫颈癌细胞表面CD47蛋白表达和mRNA水平。鉴于CD47在肿瘤细胞抗吞噬中发挥的重要作用，推测VES可能通过免疫学机制发挥抗肿瘤作用。本研究拟以宫颈癌Hela细胞为研究对象，通过检测巨噬细胞吞噬肿瘤细胞比率探讨VES对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力的影响；通过检测肿瘤细胞吞噬相关分子CD47、CRT及MicroRNAs的差异表达和作用靶点探讨VES影响巨噬细胞吞噬功能的机制；通过检测巨噬细胞表面共刺激分子和MHCⅠ/Ⅱ分子表达、上清液IL-12p40、TNFα等细胞因子水平及CD8+T细胞和CD4+T细胞增殖情况，阐明VES对巨噬细胞抗原提呈能力的影响。该研究在探讨VES经免疫机制发挥抗肿瘤作用方面有所创新,为探索肿瘤防治新方案提供科学依据。

维生素E琥珀酸酯（VES）是维生素E的衍生物，可有效抑制多种肿瘤细胞生长，对正常组织细胞无任何毒副作用。本研究从体内试验和体外试验两个方面对VES经免疫学途径发挥抗肿瘤的机制进行探讨，为探索肿瘤防治新方案提供科学依据。成果概括如下：（1）明确了VES处理人宫颈癌细胞对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力的影响。巨噬细胞与VES处理的人宫颈癌Hela细胞共培养60min后，流式细胞术显示巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的比率吞噬比率由8.1%升高到26.5%。荧光显微镜观察的结果与流式细胞术检测结果一致。（2）明确VES能够通过CD47-SIRPα通路调节巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。随着VES浓度的增高，Hela细胞抗吞噬分子CD47mRNA水平逐渐降低，细胞内促吞噬分子CRTmRNA水平逐渐增高；不同剂量VES处理Hela细胞24h后，细胞膜表面CD47蛋白表达显著降低，而细胞膜表面CRT的改变无统计学差异。（3）VES通过miRNA-155和miRNA-133调控CD47的表达，miRNA-326并未参与。荧光定量PCR结果发现VES能够诱导miRNA-155、miRNA-133和miRNA-326水平，siRNA技术阻断miRNA-155和miRNA-133后，CD47蛋白表达又有所提高；siRNA技术阻断miRNA-326后，CD47蛋白表达没有变化。（4）明确了CD47-SIRPa通路在VES诱导肿瘤细胞凋亡中的作用。流式细胞术发现与VES处理组相比，CD47抑制剂作用细胞使凋亡率由15.5%增加到21.7%；与空载体转染组相比，细胞转染CD47过表达质粒后，凋亡率由16.6%降低为8.04%。与VES处理组相比，CD47抑制剂作用细胞可提高caspase-3活化片段的表达和PARP蛋白的剪切；与空载体转染组相比，细胞转染CD47过表达质粒后，caspase-3活化片段表达和PARP蛋白的剪切有所降低。（5）建立荷瘤小鼠模型，腹腔注射高、低剂量VES后，瘤块重量和体积均明显降低，小鼠生存时间延长；肿瘤组织CD47的转录水平和翻译水平均显著降低；脾脏组织细胞因子TNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-2转录水平显著升高，而IL-10转录水平显著降低；血清细胞因子TNF-α和IFN-γ水平显著升高，而IL-10水平显著降低，进一步阐明了VES经免疫学途径发挥抗肿瘤的机制.