FATTY ACID DESATURASE 4调节植物膜联蛋白活性的分子机制研究

Plant use calcium as second messenger to regulate development and the responses to environmental cues. The up-regulation of cytosolic calcium concentration is realized by coordinated calcium influx and intracellular calcium release. Annexins have calcium channel protein activities and binding activities with phosphor lipids. So far, it still remains unknown how membrane lipids affect annexin transport activities. We found that knockout of FATTY ACID DESATURASE 4 resulted in enhanced cytosolic calcium signaling in response to heat shock, high salinity and oxidative stress. Thus, we hypothesized that FATTY ACID DESATURASE 4 is involved in the biosynthesis of phosphotidylglycerol PG36:7, and PG36:7 interacts with annexins on the plasma membrane, this interaction inhibits the calcium channel activities of annexin proteins. We plan to measure the enzyme activity of FAD4 by recombinant protein expression in yeast and in combination with lipidomics comparison between WT and fad4 mutant, these experiments will demonstrate its biochemical activities in the synthesis of plasma membrane lipid PG36:7. Next, we plan to perform fat western blotting and protein importing experiments to demonstrate the specificity of interaction between individual membrane lipid and annexins. This study will uncover the molecular mechanisms that membrane lipids regulate the calcium channel activities of annexin proteins, and provide new avenue and novel target for the improvement of plant stress tolerance.

植物利用钙离子作为第二信使来调节发育和对环境信号的反应。细胞通过协同调节外钙内流和内钙释放而实现对细胞质钙离子浓度的调节。膜联蛋白具有钙离子通道蛋白活性和磷脂结合活性，但膜脂组分如何影响膜联蛋白的运输活性还了解甚少。我们前期工作发现：FATTY ACID DESATURASE 4 基因敲除后突变体对热激、高盐和氧化胁迫诱导的细胞质钙离子信号明显增强。我们推测“FATTY ACID DESATURASE 4参与催化合成细胞质膜上磷脂酰甘油PG36：7，而PG36：7与细胞质膜上的膜联蛋白相互作用而抑制其钙离子通道活性。”我们拟在酵母中重组表达FAD4蛋白结合脂质组学技术证明FAD4在PG36：7合成中的作用，并通过脂肪蛋白质印迹实验和蛋白输入实验来证明特定脂类与膜联蛋白的相互作用。本研究将揭示膜脂组分调节膜联蛋白钙离子运输活性的分子机制，为提高植物的逆境耐受性提供新思路和新靶点。

磷脂酰甘油是植物叶绿体膜上的主要磷脂，在其sn-2位置的16C脂肪酸的C3位含有一反式不饱和键（16:1t-PG），该反式不饱和键由叶绿体膜上的FATTY ACID DESATURASE 4 (FAD4) 催化合成。近年发现植物存在另一类新的磷脂酰甘油，其sn-2位置为18C多不饱和脂肪酸，且其C3位也含有一反式不饱和键（PG36:7）,但其合成途径和功能未知。本研究阐明：1）PG36:7通过FAD4催化合成；2) fad4 突变影响细胞质膜组成，增强膜联蛋白的钙离子运输活性和非生物胁迫诱导的细胞质钙离子信号；3）叶绿体膜上的16:1t-PG参与光合产物向细胞质的运输，调节植物生长和防御反应之间的平衡。我们首先在拟南芥中成功地过量表达FAD4基因(OX-FAD4s)，同时鉴定其T-DNA插入敲除株系（fad4-2），通过比较生长表现我们发现FAD4基因过量表达或敲除植株比野生型生长加快，且其可溶性代谢物含量比野生型降低。这些结果揭示叶绿体膜上磷脂酰甘油的稳态调节可能参与光合产物向细胞质的运输。我们利用脂质组学方法比较了Col, fad4-2和OX-FAD4之间极性膜脂的变化规律，证实了FAD4催化合成16:1t-PG；同时揭示FAD4可能也参与PG36:7合成，我们提出了一个FAD4参与PG36:7合成的生化途径模型。与fad4-2在连续光照下较快的生长和较低的可溶性代谢物水平相对应，我们发现fad4-2突变体对多种逆境胁迫敏感，高温和氧化胁迫诱导的细胞质钙离子信号明显增强。我们通过脂质体结合实验鉴定出两个膜联蛋白（AtANN2和AtANN4）参与FAD4介导的外钙内流；通过脂肪-蛋白质印迹技术证明膜联蛋白与磷脂酸和磷脂酰丝氨酸存在强互作，而与磷脂酰甘油互作较弱，与磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺没有互作。fad4突变可能改变细胞膜磷脂组成，这种膜磷脂组成变化能够增强细胞膜质与膜联蛋白之间的互作，从而增强膜联蛋白钙离子运输活性，导致细胞质钙离子升高，以及对逆境胁迫敏感性增强。本研究揭示FAD4整合代谢和防御信号来调节植物生长反应。.关键词：拟南芥，磷脂酰甘油，脂肪酸去饱和酶4，生长速率，胁迫反应