rhomboid家族分子调控小胶质细胞糖酵解在术后认知功能障碍中的作用和机制研究

The regulating mechanism of microglia activation is an important subject in the research of POCD. Although it is well known that rhomboid family contributes to innate immune regulation significantly, its role in the development of POCD remains unknown. Therefore, we screened the expression of rhomboid family in the hippocampus systematically and found that Rhbdd2 increased among the POCD mice. A group of Rhbdd2 KO mice were made and we found that the cognitive function of Rhbdd2-/- POCD mice decreased more than wild-type mice, which suggests Rhbdd2 inhibits POCD progress. Meanwhile, inflammatory factors increased more in the hippocampus. Both the key enzymes hexokinase 2 (HK2) and pyruvate kinase 2 (PKM2) in microglia of Rhbdd2-/- mice were upregulated significantly. These results suggests that Rhbdd2 may regulates microglia activation through regulating glycolysis, which may relieve the symptoms of POCD. The current program was designed to explore the molecular mechanism of Rhbdd2 regulating the activation of microglia through some experiments in Rhbdd2 KO mice and in vitro study in microglia, which would provide further understanding of POCD mechanisms and new target for intervention on this disease.

术后认知功能障碍（POCD）中小胶质细胞活化的调控机制是POCD研究中重要的科学问题。rhomboid家族分子在天然免疫调控中发挥重要作用，但在POCD进展中的作用未知。据此，我们在POCD小鼠疾病模型中系统筛选了海马组织中rhomboid家族分子的表达，发现Rhbdd2表达明显上调，因而构建了Rhbdd2 KO小鼠，发现Rhbdd2-/-小鼠POCD疾病模型认知功能障碍加重，提示Rhbdd2可抑制POCD的发生发展。我们同时发现，其海马区炎症因子分泌增加，原代培养Rhbdd2-/-小胶质细胞活化后糖代谢关键酶HK2及PKM2的表达均显著增加，进一步提示Rhbdd2可能通过调控糖酵解进而调节中枢小胶质细胞活化，从而减轻POCD的发生发展。本项目拟从基因敲除小鼠、离体细胞方面，探索Rhbdd2通过调控糖酵解调节小胶质细胞活化的分子机制，以期为POCD提供发生新机制和干预新靶点。

2018年11月国际麻醉学杂志将与麻醉和手术相关的认知功能改变正式命名为围术期神经认知障碍（perioperative neurocognitive disorders，PNDs），取代术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）。小胶质细胞活化的调控机制是PNDs研究中重要的科学问题，rhomboid家族分子在天然免疫调控中发挥重要作用，但在PNDs进展中的作用未知。据此，我们在PNDs小鼠疾病模型中系统筛选了海马组织中rhomboid家族分子的表达，发现Rhbdd2表达明显上调，因而构建了Rhbdd2 KO小鼠，发现Rhbdd2-/- 小鼠PNDs疾病模型认知功能障碍加重，提示Rhbdd2可抑制PNDs的发生发展。我们首先在BV-2/N9小胶质细胞株转染siRNA干扰Rhbdd2表达后，从mRNA和蛋白质水平检测LPS诱导的炎症因子产生的变化发现，与对照组相比，Rhbdd2 敲减后的小胶质细胞分泌炎症因子明显增加；然后我们利用Rhbdd2条件性基因敲除小鼠观察Rhbdd2对POCD发生发展的影响。Rhbdd2-/- 和野生型老年小鼠在Morris水迷宫连续适应性训练5天后，构建POCD模型，术后第3天进行旷场实验，并分别于术后第3天及第7天进行Morris水迷宫实验，检测两组小鼠的认知功能变化，同时使用免疫荧光及qRT-PCR检测不同时间点两组小鼠海马组织中炎症因子的表达差异。Morris 水迷宫检测发现Rhbdd2缺失使得小鼠认知功能障碍加重，而海马区炎症因子表达增加。利用原代培养的野生型和Rhbdd2-/- 小鼠海马小胶质细胞在蛋白质水平和mRNA水平观察LPS诱导炎症因子的产生差异，发现Rhbdd2-/- 小鼠海马小胶质细胞炎症因子较野生型增加更为显著；原代培养的Rhbdd2-/- 小胶质细胞活化后糖代谢关键酶HK2 与GluT1的表达均较野生型增加更为显著，进一步提示Rhbdd2可能通过调控糖酵解进而调节中枢小胶质细胞活化，从而减轻PNDs的发生发展。此外，我们还证实乙酸通过抗炎和抗氧化作用抑制小胶质细胞活性，从而改善PNDs神经认知功能。本项目从基因敲除小鼠、离体细胞方面，探索Rhbdd2通过调控糖酵解调节小胶质细胞活化的分子机制，以期为PNDs提供发生新机制、干预新靶点及可能的防治新策略。