维生素C促进猪pre-iPSC阶段到iPSC阶段重编程过程中DNA甲基化的变化

At present low efficiency and poor quality of iPSC is a bottleneck in their application to clinical treatment.General agreement that a major cause of low efficiency of iPSC goes through a pre-iPSC stage in somatic cell reprogramming process. Somatic cells can be fully reprogrammed only to bypass pre-iPSC stage. Histone demethylating enzymes activity of Jhdm1a and Jhdm1b are regulated to maintain Dlk1-Dio3 imprinting by Vitamin c, which contribute to iPSC completely reprogrammed state. Vc may promote the 5mC of Tet family members into 5hmC, perhaps this is a potential mechanism for somatic cell reprogramming. In this project we have already acquired the iPSC in pigs. Vc is added to promote iPSC reprogramming of pigs to identify methylation changes of exogenous and endogenous genes from pre-iPSC phase to the iPSC phase. Further the project is to reveal a signaling pathway of reprogramming that Vc mediate Tet family members that make 5mC hydroxylation into 5hmC. The project study that Tet1 and Tet2 maintain iPSC pluripotency to have an important role in two different reprogramming phases (middle and later stages of reprogramming).

目前iPSC诱导效率低和质量不好是其应用到临床治疗的一个瓶颈。普遍认为导致iPSC效率低的一个主要原因是在体细胞完全重编程的过程中要经历一个pre-iPSC阶段，只有体细胞绕过该阶段才能进行完全重编程。Vc通过调节组蛋白去甲基化酶Jhdm1a 和 Jhdm1b 的活性来维持 Dlk1-Dio3 印迹，进而促进iPSC达到完全重编程的状态。Vc可能促进Tet家族成员羟化5mC成为5hmC，或许是Vc促进体细胞重编程的一种潜在机制。本项目在我们已经获得猪iPSC的工作基础上，通过Vc添加进而促进猪iPSC的重编程，旨在确定pre-iPSC阶段到完全重编程iPSC阶段中外源基因和内源基因甲基化的动态变化过程。进而揭示Vc介导Tet家族成员羟化5mC成为5hmC的重编程信号通路，以及Tet1和Tet2基因在两个不同的重编程阶段（中、后期重编程阶段）中iPSC诱导及iPSC多能性维持中的重要作用。

目前iPSC诱导效率低和质量不好是其应用到临床治疗的一个瓶颈。目前人和小鼠的iPSC诱导体系已经基本完善，能够获得较高诱导效率和较好的克隆质量。但是猪的iPSC诱导体系还很不完善，导致诱导效率及质量偏低。维生素C促进Tet家族成员羟化5mC成为5hmC，或许是Vc促进体细胞重编程的一种潜在机制。. 本项目在前期的工作基础上不断的优化猪iPSC的诱导体系，诱导形成的iPSC克隆可以被碱性磷酸酶染色。在三种培养基条件下，7.5%KSR+2i+2.5%ES培养基条件下诱导形成的克隆数量显著高于15%KSR-2i和15%KSR+2i培养基条件下。iPSC中的内源多能性基因的表达被激活，Oct4、Nanog、Sox2、Lin28均呈现较高的表达水平。对4种ESC标记基因Oct4、 Nanog 、SSEA4和Sox2进行免疫荧光染色，证实均有表达。通过将iPSC进行悬滴法培养，可以形成拟胚体，并表达三胚层的分化标记。将所获得的iPSC克隆，分五个点注射免疫缺陷小鼠，可见三胚层代表结构，包括外胚层的神经上皮、中胚层的平滑肌和内胚层的腺泡样结构。筛选Vc处理猪诱导iPSC体系的最佳浓度，结果表明：Vc浓度在60μg/ml和80μg/ml时诱导效率高于其他实验组。60μg/ml Vc处理组可以显著提高Nanog的相对表达量，而10μg/ml和20μg/ml Vc处理组可以显著提高Oct4的相对表达量，100μg/ml和150μg/ml Vc处理组可以显著提高Sox2的相对表达量，20μg/ml和60μg/ml Vc处理组可以显著提高Y-WH的相对表达量，80μg/ml Vc处理组可以显著提高Tet1的相对表达量，60μg/ml Vc处理组可以显著提高Tet2的相对表达量。筛选出最佳的Vc处理浓度是60μg/ml。最佳Vc添加组Nanog相对表达量随着诱导天数递增，有显著增加的趋势。. 成功建立猪iPSC的诱导体系，其具有一定的发育潜能。不同浓度的Vc处理组对于多能性基因的相对表达量有影响，最佳的Vc处理浓度是60μg/ml。同时发现，添加Vc并不能加快细胞重编程进程，但能显著提高其克隆生产率。随着Vc处理诱导天数的增加，多能性基因的表达显著提高。60μg/ml和80μg/ml Vc可以显著提高Tet1和Tet2的相对表达，有利于重编程过程中的去甲基化