基于表观遗传修饰探析衰老大鼠高皮质酮致海马GR-学习记忆关键蛋白下调的分子机制及补肾益气方药的作用

Degenerative changes in the hippocampus region of the brain are the important pathological mechanism of learning and memory impairment of the aging body. Previous studies have founded that in aged rats HPA axis hyperfunction lead to excessive secretion of corticosterone which interaction with its receptor (GR) in hippocampus in a feedback mode to make it show " toxic " reaction, resulting in decrease of key proteins expression and learning and memory ability.Combining epigenetic modification progression proposed recently , we hypothesized that abnormal of epigenetic modification may down regulated the expression of GR in hippocampus and thereby be an important factor affecting key proteins releated to learning and memory , may be an important root cause of higher corticosterone induced learning and memory impairment in aging.This study intends to observe the degenerative changes of epigenetic modification enzyme protein (DNMT, HACT, HDAC, MeCP2)and RNA interference in rat hippocampal neural cells in vitro and in vivo, with MSP, ChIP, micro-RNA microarray, Q-RT-PCR, Western blot and other molecular biology techniques, and to analyze molecular mechanisms of high corticosterone →hippocampal GR→ down regulated key proteins releated tolearning and memory (arc, Syn1 and Gabra5 etc.) from the perspective of gene epigenetic modifications. This study also intends to observe the interference effect of kidney-tonifying recipe, Qi-benefiting recipe and active ingredients of traditional Chinese medicine on degenerative changes of those above indicators and provide experimental basis and new targets for reinforcing kidney and replenishing qi to nourish the brain.

大脑海马区域退行性变化是衰老性学习记忆损害的重要病理机制。我们前期实验发现，老年大鼠HPA轴过度亢进导致分泌过多皮质酮，反馈作用于海马相应受体（GR）使之呈现"毒性"反应，以致关键蛋白表达及学习记忆能力下降。结合新近提出的表观遗传修饰机制，我们推测表观遗传修饰异常可能是大脑海马区域GR表达下调，进而影响学习记忆关键蛋白下降的重要原因，高浓度皮质酮是引起衰老相关性学习记忆损害的重要根源。本课题拟采用MSP、ChIP、mi-RNA芯片、Q-PCR、Western blot等分子生物学方法，从体内、外观察大鼠海马神经细胞表观遗传修饰酶蛋白（DNMT、HACT、HDAC、MeCP2）的退行性变化，从基因表观遗传修饰角度解析高皮质酮-海马GR-学习记忆关键蛋白（Acr、Syn1、Gara5等）下调的分子机制，及补肾、益气方药、中药有效成分对上述指标变化的干预作用，为补肾、益气健脑提供新的科学依据。

本项目在前期国自项目（30873317）基础上，结合国外新近提出的表观遗传假说，推测表观遗传修饰的衰老性变化可能是高水平皮质酮（CORT）致海马“毒性”和学习记忆损害的重要原因。本课题主要从体内、外观察大鼠海马神经细胞表观遗传修饰酶蛋白（DNMT、HAT、HDAC）的变化，着重从基因的表观遗传修饰角度探析高CORT -海马GR-学习记忆关键蛋白（Acr、BDNF等）下调的分子机制，及补肾益气方药及其有效成分的干预作用。结果发现，与青年对照组相比，老年大鼠血清CORT显著升高，大脑海马神经突触数量明显减少，表观遗传修饰酶（DNMT和HDAC2增高，HAT下降）基因表达以及miRNA表达谱发生异常变化，学习记忆相关基因启动子CpG岛甲基化增高，组蛋白乙酰化修饰（H4K12Ac）下降，gabra-5和fkbp5表达增高，海马GR蛋白表达显著降低，学习记忆相关基因（arc、bdnf、syn-1等）表达下降，LTP明显受抑，学习记忆能力显著下降。补肾益气方药左归丸、益气聪明汤可以通过降低老年大鼠血清CORT含量，改善表观遗传修饰酶基因表达和miRNA表达谱的异常变化，降低基因启动子CpG岛甲基化和增高组蛋白乙酰化修饰（H4K12Ac），降低gabra-5和fkbp5表达，上调GR和学习记忆相关基因的表达，提高LTP。进一步体外实验发现，与对照组比较，高浓度CORT可降低神经细胞活性，使细胞突起变细、变短、活性下降，上调GABRA5和DNMT1、HDAC2基因表达；提高基因(Syn1)启动子甲基化和降低组蛋白乙酰化修饰(H4K5AC），增高miR-142-3p等表达，下调学习记忆相关基因GR、arc、bdnf、syn1表达。而甘露三糖和黄芪甲苷及两药合用可提高模型细胞活性，降低DNMT1、HDAC2和miRNA(miR-142-3p等）的表达，降低基因启动子甲基化水平和增高组蛋白乙酰化修饰，改善损伤细胞学习记忆相关基因的表达。本项目研究验证了表观遗传修饰的衰老性变化可能是高水平CORT致海马“毒性”和学习记忆损害的重要原因，补肾益气方药及其有效成分甘露三糖和黄芪甲苷可以通过纠正上述各项指标的异常变化，改善脑功能、延缓学习记忆退化。研究结果丰富了中医补肾填精、益气升阳健脑的科学内涵，提供了科学的实验依据。