磁性纳米材料生物制备及在食品安全分析中应用基础研究

人工合成免疫磁珠检测技术应用日益广泛并体现出一些特殊的优越性，科学工作者意识到微生物来源磁性颗粒(BMPs)具有更加广阔的应用前景。趋磁细菌自被发现以来，其难以纯化培养及低密度是相关研究的世界难题。本课题旨在基于代谢产物分析基础上的代谢调控发酵和运用代谢工程技术削减氧胁迫的研究策略，寻找趋磁细菌普遍存在的不易培养、低细胞密度和低产率BMPs问题。通过对发酵产物分析，利用藕联发酵和改变流动气相组成等手段进行代谢调控；研究高效固体平板培养技术、构建以高效电转化的遗传转化体系；在趋磁菌AMB-1中过量表达超氧化物歧化酶(SOD)，研究高效分离BMPs方法以及利用BMPS为载体的免疫磁珠法在食品安全分析中应用基础研究。本研究涉及无机化学、生物矿化、微生物学、基因工程、免疫分析领域的知识和手段，是一项跨学科的前沿性课题，具有重要的理论意义和实际应用价值。

趋磁菌Magnetospirillum AMB-1产生的磁小体是一种晶型完美、单分散性、生物性能良好的纳米级Fe3O4型磁性微球，其粒径分布在为50-100nm，磁学特性与通过化学合成的磁性微球相当。细菌磁小体作为一种有待于开发利用的磁性纳米材料，在医学、生物学、电子学等有广泛应用前景。目前，趋磁菌 AMB-1生长密度及磁小体合成能力低，本研究主要尝试对AMB-1的代谢调控发酵、抗氧化代谢基因工程菌磁小体合成、高效BMPs提纯方法、免疫BMPs制备等方面进行探索研究。研究结果如下：. (1) 代谢调控发酵：探索了一系列浓度梯度的不同种类的还原剂对该菌生长及产磁的影响，实验结果表明：培养基中加入还原型谷胱甘肽(GSH)以及连二亚硫酸钠能够有效提高该菌的生长密度；培养基中加入GSH以及L-半胱氨酸能够增强AMB-1磁小体合成的能力。. (2) 代谢基因工程菌构建：对趋磁菌AMB-1的两个超氧化物歧化酶Fe-SOD及Cu/Zn-SOD从初级结构到空间结构等生物信息学方面进行初步研究；趋磁菌AMB-1来源的fesod和 cu/znsod 在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行克隆表达，重组菌株E.Coil BL21 (DE3)/pET-20b-cu/znsod-histag生长速率及生长最终密度明显高于对照组E.Coil BL21 (DE3)/pET-20b；为提高趋磁菌AMB-1对氧的耐受水平，尝试通过基因工程手段增强该菌内Fe-SOD和 Cu/Zn-SOD两种超氧化物歧化酶的表达水平，构建了两个游离型重组载体pBBR1-P16-fesod-histag 和 pBBR1-P16-cu/znsod-histag，构建了两个同源重组整合型载体pET-20b-rDNA-P16-fesod-histag和pET-20b-rDNA-P16-cu/znsod-histag。. (3) BMPs提纯及免疫BMPs制备：采用多种方法提取磁小体，得到酶加超声破壁分离效果好。利用二种方法制备了溴氰菊酯人工免疫抗原，用合成的人工免疫抗原免疫新西兰大白兔，制备出抗血清，取效价高的抗血清，经分离纯化、效价和交叉反应率测定，选A1号抗体作为免疫磁珠抗体。确定了包被磁珠的最佳偶联条件(包括最佳反应介质，最佳温度，最佳时间)。