微流控电化学传感体系中利用特异蛋白识别进行外泌体分离富集和检测的研究

Tumor-derived exosomes play a pivotal role among cancer cells and the cells in tumor microenvironment. They are stable in body fluids and reflect tumor status sensitively. Exosomes are being evaluated as promising biomarkers in tumor liquid biopsy. However, isolation of such diverse nanoscale exosome vesicles from complex biological matrices are technically challenging. In our previous work, we found that it is difficult to capture complete exosomes when trapping exosomes with an immune-affinity approach. Therefore, we are constructing an integrated microfluidic platform that enables on-chip isolation, enrichment, detection and release of exosomes. A multi-confined structure and specific protein receptor are designed to enhance the magnetic beads capture efficiency for the exosomes flowing through the microchannel. Cell-specific exosomes can be detected by utilizing a signal transduction strategy in the aptamer-functionalized electrodes. Based on this specific biorecognition mechanism, we developed a novel electrochemical sensor as well as a quick visualization analysis. Finally, the complete exosomes collected in this microfluidic platform could be used for analysis of their microRNA contents and proteomics. Thus, this integrated platform could provide a simple but useful tool to facilitate basic and clinical investigations of exosomes for non-invasive cancer diagnosis, real-time detection and precision treatment.

肿瘤来源的外泌体（Exosomes）在肿瘤微环境的胞间通讯中发挥着特殊作用，它们在体液中含量稳定且能够灵敏的反应出肿瘤的实际状态，被认为是“液体活检”技术中一种极具潜力的肿瘤标志物。外泌体研究中面临的首要困难是如何从复杂的生物样品中分离出这些微小囊泡，我们在前期的研究中发现，当前基于抗原-抗体作用捕获的方法很难获得完整的外泌体。因此，本项目拟在微流控芯片上构建一种新颖的集分离富集、检测和释放为一体的外泌体综合分析平台，引入多重限制结构和特定结合蛋白来增加磁珠亲和捕获外泌体的效率，同时在电极表面构建一种针对特定外泌体的核酸适配体信号转换器，使其在高特异性外泌体识别的基础上完成同步电化学传感分析，并可进行快速的可视化判断。最后收集到完整的外泌体，可进一步用于外泌体内部microRNA和蛋白质组学分析。该集成体系操作简便易推广，有望在评估肝癌进展、实时检测等方面提供一个有效的技术平台

肿瘤来源的外泌体（Exosomes）在肿瘤微环境的胞间通讯中发挥着特殊作用，它们在体液中含量稳定且能够灵敏的反应出肿瘤的实际状态，被认为是“液体活检”技术中一种极具潜力的肿瘤标志物。该项目借助识别肿瘤来源外泌体特异蛋白的适配子，设计了一系列灵活可控的DNA探针用于乳腺癌外泌体的特异性检测，该模拟酶反应不仅具有方便、省时的优点，而且所产生的信号易于被肉眼观察到。此外，这种基于DNA结构转换的信号策略，可根据需要设计多种分子探针序列，在检测多用途靶点方面有很大的潜力。结合微流控芯片技术，该项目构建了一种集混合、分离富集和检测为一体的肝癌相关外泌体分析平台（ExoPCD-chip）。该芯片由一个Y型微柱阵列组成的捕获区域和级联的ITO电极组成，仅需30 μL样品在3.5小时内即可完成整个分离富集和检测的全过程。更为重要的是，对血清样品的分析结果证明该芯片能够有效区分肝癌病人和健康人，具有临床检测和癌症诊断的潜力。此外，通过N-G/FePc/Nafion/PLL复合物对ITO电极的修饰，开发了一种可用于实时检测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）释放NO量的电化学传感微芯片。该平台完全满足细胞生长所需条件并且对NO的释放响应迅速，实现了该体系内药物刺激后NO浓度变化的实时监控，有望应用于多种复杂的生物体系中。随着外泌体研究的进一步深入，利用外泌体作为天然载体的优势，构建了一种多肽包裹的外泌体复合物用于反义寡核酸链的胞内递送，实现了肿瘤细胞内抗凋亡基因的沉默及相应蛋白的下调。该工作为核酸的胞内递送提供了一种简便快速的策略，为个性化肿瘤药物的设计提供了新的思路。