5-HT通过PTHrP信号通路调控围产期奶山羊血钙和乳钙代谢平衡的分子机制

Hypocalcaemia is a metabolic disease which happens easily to perinatal dairy goats and causes huge economic losses. Xinong Saanen Dairy Goats are used as test material in this project. Firstly, primary goat mammary epithetical cells (GMECs) are segregated and the stable TPH1 knockout GMEC line (TPH1 -/- GMEC) is established by CRISPR/Cas9 system（There is no 5-HT biosynthesized in the cells which can’t express TPH1 protein.）. Seconedly, the mRNA and proteins expression of PTHrP signaling pathway relevant genes and intracellular Ca2+ levels are detected after changing the 5-HT and PTHrP levels in GMECs and TPH1 -/- GMECs using RNA interference technique and treated with 5-HTP, respectively. Thirdly, through changing 5-HT concentration in blood by adding 5-HTP to daily ration and the first milking time in advance in perinatal dairy goats, the mechanisms of 5-HT regulating PTHrP and Ca2+ levels in blood and milk are analyzed. Lastly, all above research results from primary GMECs, TPH1 -/- GMECs and living dairy goats will mutual corroborate the molecular mechanisms of 5-HT regulating calcium metabolic balance of perinatal dairy goat blood and milk through PTHrP signaling pathway. The molecular mechanisms will provide a theory basis for breeding dairy goats of resistance to hypocalcaemia disease and developing feed additive.

低血钙症是围产期奶山羊极易发生的代谢疾病，对奶山羊生产造成巨大经济损失。本项目以围产期西农莎能奶山羊为试材，分离原代山羊乳腺上皮细胞（GMECs）；采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建稳定敲除TPH1基因的细胞株TPH1-/-GMEC（没有TPH1表达的细胞不能合成5-HT）；利用RNA干扰技术和添加5-HTP的方法改变原代GMECs和TPH1-/-GMECs中的5-HT和PTHrP水平，检测细胞中PTHrP信号通路基因表达和细胞分泌Ca2+的变化；通过在日粮中添加5-HTP和提前首次挤奶时间，改变围产期奶山羊血液中的5-HT水平，分析血液中5-HT对PTHrP、血钙和乳钙浓度的调控机制。通过在原代细胞、细胞株和奶山羊个体中的研究结果的相互印证，阐明5-HT通过PTHrP信号通路调控围产期奶山羊血钙和乳钙代谢平衡的分子机制，为抗低血钙症奶山羊的选育和饲料添加剂的研发提供理论依据。

奶山羊是重要的产奶动物。低血钙症是围产期奶山羊极易发生的代谢性疾病，在生产中造成巨大的经济损失，对奶山羊产业发展具有严重危害。5-HT是近年来新发现的一种乳腺生理调节器。本项目以围产期奶山羊和离体培养的山羊乳腺上皮细胞为研究对象，探究了五羟色胺对围产期奶山羊钙稳态的影响及其调节机制。奶山羊活体试验中，采集分离了围产期萨能奶山羊血清，利用ELISA试剂盒检测了血清中5-HT、PTHrP和Ca2+的浓度，并进行相关回归分析，结果表明围产期奶山羊血液中，5-HT浓度、PTHrP浓度和Ca2+浓度三者之间两两呈正相关关系；两个产羔季重复开展了给围产期奶山羊注射5-HTP的试验，研究了围产期奶山羊注射5-HTP（1 mg/kg BW）对其血清及乳中5-HT、PTHrP、Ca2+浓度、乳成分的影响，结果显示奶山羊产前7天开始注射5-HTP能够提高山羊体循环中5-HT水平，同时血液中PTHrP浓度及Ca2+浓度随5-HT浓度升高，说明5-HT能够提高围产期奶山羊血液中的PTHrP和Ca2+浓度，具有预防围产期奶山羊低血钙症的潜力；此外还探究了产前挤奶（在预产期前3天模拟人工挤奶按摩奶山羊乳房）对于围产期奶山羊钙稳态的影响，发现产前挤奶有助于提高山羊初产时期血清和乳汁中PTHrP水平，但血清钙水平降低了，其原因尚不清楚。体外试验中，成功分离得到原代山羊乳腺上皮细胞(GMECs)，并利用CRISPR/Cas9技术构建了5-HT合成缺陷的TPH1-/-GMECs细胞株；研究了5-HT对GMECs钙代谢、增殖和凋亡的作用及分子调控机制。揭示5-HT一方面能够通过调节PTHrP/CasR信号轴促进细胞内钙离子增加，另一方面也能够通过miR-99a-3p/ATP2B1的非编码RNA信号途径使得细胞内钙水平升高；同时明确175 µM浓度的 5-HTP对山羊乳腺上皮细胞具有促增殖、抑凋亡的作用，且5-HTP通过MAPK/Bcl-3信号通路促进山羊乳腺上皮细胞增殖，抑制其凋亡。本研究结果为进一步阐明围产期奶山羊钙代谢平衡机制积累了资料，为预防围产期奶山羊低血钙症提供了有效方法和科学依据，对于奶山羊产业发展具有重要的理论价值与现实意义。