基于DNA条形码及metabarcoding技术研究中国特有华溪蟹属生物多样性

There are 84 species or subspecies belong to genus Sinopotamon which is endemic and has the largest amount of species in Chinese mainland with accounting for 29.68% of total 284 species of freshwater crab in China. Based on the applicants preliminary exploration about biodiversity and DNA barcoding, and holotype morphological database of genus Sinopotamon, and more than 8000 specimens from 337 locations covering 17 provinces; with knowledge and technique of Crustacea, molecular biology and bioinformatics the applicant plans to arrange and collect more than 40 species, screen DNA barcoding standard genetic sequences of genus Sinopotamon within COI, 16S rRNA and ITS etc, and aim to establish systemic DNA barcoding; simultaneously to analyze the species group composition and its feature of genus Sinopotamon in Wuyi mountains natural conditions with high-throughput DNA sequencing platforms and DNA barcoding method. The scientific value of the research is that with discovering how to synthesize multi-classifying means, there would be quick and accurate to identify certain species or confirm potential new species, as well as assess the species composition of genus Sinopotamon in different natural environments, and finally there would be disclosed that the biodiversity and molecular differentiation mechanism of genus Sinopotamon on Chinese freshwater crab zoographical distribution; additionally there would discuss the feasibility about using DNA metabarcoding to analyze qualitatively the composition of genus Sinopotamon under natural environment.

华溪蟹属为中国大陆特有且系物种多样性最丰富的一个属，有84种或亚种，占我国淡水蟹类284种的29.68%。基于申请人等对其生物多样性及DNA条形码开展的初步探索，和采获17省区337个样点8千余标本，及所构建该属模式标本形态数据库等工作基础。拟采取甲壳动物学、分子生物学及生物信息学方法，整理、采集不少于40个物种，以线粒体基因为主，参考部分核基因，筛选华溪蟹属DNA条形码标准基因序列，建立DNA条形码系统；同时依托高通量测序平台，以DNA metabarcoding策略评估武夷山脉华溪蟹属自然居群的物种组成及特点。本项目的科学价值旨在探索综合多种分类手段，高效准确评估不同环境下华溪蟹属的物种构成，实现物种快速准确鉴定，发现可能存在的新种或隐存种，揭示其在中国淡水蟹类地理区划中的生物多样性格局和分子分化机制；探讨DNA metabarcoding对华溪蟹自然居群的物种多样性定性分析的可行性。

依据计划任务书拟定的华溪蟹属溪蟹物种数量及样品规模，基本建立了华溪蟹类 DNA 条形码体系。并在此基础上将 DNA metabarcoading 策略应用于华溪蟹类淡水溪蟹的生物多样性评估。项目研究是在完成对研究室所保藏的华溪蟹属标本系统整理的基础上，三次前往我国西北、华北、华东地区十余县市区采集样本；基于与模式标本比对的形态学分类鉴定及提取DNA和建立凭证样品库；并在序列比对与分析的基础上筛选和优化华溪蟹类DNA 条形码标准基因序列及其引物继而建立华溪蟹类DNA 条形码系统；选择合适的条形码序列及引物，依托高通量测序平台得到凭证样品库中华溪蟹类条形码基因扩增子序列；对秦岭、武夷山脉自然条件下不同采集样点的华溪蟹类混合DNA 进行扩增，及采用生物信息学方法分析扩增子序列数据集和选择与形态学分类结果呈一致性的可操纵分类单元(operational taxonomic units,OTUs)，探讨与评估DNA metabarcoading 方法对不同自然条件下淡水蟹类样本集群中物种组成的还原能力。.此外，新增计划任务书计划以外的相关内容，例如筛选出CO I基因200 bp的序列片段作为DNA mini-barcoding；修水华溪蟹等4物种完整线粒体基因组原始数据并上传至GenBank、基于线粒体全基因组分析其在短尾类中的系统发生关系的研究、尚包括对淡水溪蟹分歧时间（分子钟）的估算等，使之对我国大陆淡水蟹类的遗传与分化有了更新的认识与理解。.本研究进一步明确华溪蟹属及其物种为中国大陆特有属，而且是物种多样性最为丰富的一个属，并进一步确立华溪蟹属淡水蟹类在中国自然地理分界线秦淮线的分布格局，整体呈现南多北少、西多东少的显著地理分布特征。项目执行期间，培养了硕士研究生5名，其中毕业3名；在国内外学术期刊公开发表学术论文合计12篇；参加国内外学术会议4次计20余人次，会议收录论文摘要合计29篇，由此增进了与同行间的了解并与之建立了友好合作关系。