类胰蛋白酶活化内皮祖细胞在乳腺癌血管新生中的作用及机制研究

骨髓和外周血来源的内皮祖细胞(EPCs)的动员与活化可促进肿瘤血管新生。肿瘤细胞及其微环境可分泌多种因子诱导EPC活化。本课题组前期研究发现肿瘤微环境中类胰蛋白酶与乳腺癌血管新生密切相关。PAR-2是类胰蛋白酶的受体，而EPC和乳腺癌细胞均表达PAR-2。因此设想类胰蛋白酶促进乳腺癌血管新生与PAR-2介导的EPC活化有关。本课题首先分离培养人脐血EPC,体外观察类胰蛋白酶对其迁移、增殖、管腔形成的影响；另用类胰蛋白酶处理人乳腺癌细胞MB-MDA-231后与EPC共培养观察EPC的活化情况，并探讨PAR-2受体与ERK-1/2和p38MAPK途径的作用。其次建立MB-MDA-231细胞裸鼠移植瘤模型，利用本组构建的类胰蛋白酶过/干扰表达慢病毒载体及DAPI标记的EPC，体内观察EPC的归巢及活化并探讨机制。通过体内外实验，本课题的研究将为抗肿瘤血管新生药物的研制提供新的分子基础和理论依据。

骨髓和外周血来源的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的动员与分化可促进血管新生,在肿瘤血管新生中起重要作用。肿瘤细胞及其微环境可分泌多种因子诱导EPC活化。近年证实，癌组织周围及癌组织内均存在数量不等肥大细胞（Mast cell, MC）浸润，肥大细胞可以分泌多种促血管形成因子，类胰蛋白酶（tryptase）是肥大细胞含量最多的介质，其本身也具有激活肥大细胞的作用。本课题组前期研究发现肿瘤微环境中类胰蛋白酶与乳腺癌血管新生密切相关。PAR-2是类胰蛋白酶的受体，而EPC和乳腺癌细胞均表达PAR-2。因此设想类胰蛋白酶促进乳腺癌血管新生与PAR-2介导的EPC活化有关。.首先，本课题分离培养人脐血EPC,体外观察类胰蛋白酶对其增殖、迁移及管腔形成的影响，并探讨类胰蛋白酶是否通过PAR-2受体起作用。 结果显示，晚期EPC表达PAR-2受体， Tryptase促进EPC的迁移及管腔形成，PAR-2激动剂具有类似tryptase作用，而tryptase 抑制剂APC366或PAR-2抑制剂SAM具有抑制tryptase的作用。但是，Tryptase以及PAR-2激动剂对EPC的增殖没有影响。其次，本课题探讨AKT和ERK途径的活化是否参与类胰蛋白酶活化EPC的作用。Tryptase预处理MB-MDA-231细胞并收集条件培养液。结果发现，Tryptase或条件培养液均可增加EPC中PAR-2、P-AKT、P-ERK以及VEGFR2 (KDR/Flk-1)的表达。说明tryptase可以直接作用于EPC，也可以通过乳腺癌细胞MB-MDA-231对EPC起作用。最后，通过建立MB-MDA-231细胞裸鼠移植瘤模型，利用本组构建的类胰蛋白酶过/干扰表达慢病毒载体及活细胞染色剂 CM-Dil标记的EPC，体内观察EPC的归巢及活化并探讨机制。结果显示, Tryptase过表达促进MB-MDA-231移植瘤的生长，其机制可能与tryptase活化EPC促进移植瘤的血管生成有关。本课题的研究可为抗肿瘤血管新生药物的研制提供新的分子基础和理论依据。