FOC1调控甘蓝枯萎病抗性的分子基础

Cabbage is an important vegetable cultivated worldwide. In recent years, cabbage Fusarium wilt (CFW), caused by Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans has spread quickly and caused great loss in China. In the previous study, we identified a cabbage line ‘96-100’ with high resistance to CFW pathogen race 1, and the genetic analysis revealed a single dominant pattern for the resistance gene. We further obtained the candidate resistance gene FOC1 through map-based cloning. Recently, we discovered in the gain-of-function test that the highly susceptible cabbage line ‘01-20’ showed high resistance to CFW after over-expression of FOC1. In the current study, we aim to further validate FOC1 function through the loss-of-resistance phenotype of the FOC1-knockout ‘96-100’ plants, using CRISPR/Cas9 gene editing technique. Gene structure, natural variance type and expression profile will be analyzed to clarify the characteristics of FOC1. Finally, the obtained near-isogenic transformed cabbage materials will be submitted for RNA-seq, with the purpose of discovering the key genes and pathways involved in FOC1-regulated resistance response. These studies will facilitate understanding of the molecular resistance mechanism of cabbage to CFW, and will also be of great significance for molecular-designed CFW resistance breeding.

甘蓝是世界范围内广泛种植的重要蔬菜作物，由尖孢镰刀菌引起的甘蓝枯萎病近几年在我国迅速蔓延并造成重大损失。在此前的研究中，我们筛选获得了对枯萎病1号小种表现高抗的甘蓝材料‘96-100’，遗传分析表明其抗性符合显性单基因遗传，进一步利用图位克隆获得了抗性候选基因FOC1。目前，我们在转化试验中发现高感甘蓝材料‘01-20’在过表达FOC1后对枯萎病表现高抗。本研究拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除‘96-100’的FOC1基因，利用敲除植株预期抗性丧失的表型进一步确认FOC1的功能；针对基因结构、自然变异类型、转录表达特征等进行分析，明确FOC1的特征特性；利用获得的近等基因系转化材料，通过RNA-seq分析FOC1调控的抗性应答反应中的关键基因及信号通路。预期研究结果可为解析甘蓝对枯萎病抗性的分子机制提供依据，对于指导甘蓝分子设计抗枯萎病育种也有重要意义。

甘蓝是世界范围内广泛种植的重要蔬菜作物，由尖孢镰刀菌引起的甘蓝枯萎病近几年在我国迅速蔓延并造成重大损失。枯萎病是一种难以通过传统手段防控的土传病害，培育和应用抗病品种是最理想的应对措施，而定位和挖掘抗性基因、解析抗性调控机制是将其用于育种的前提条件。在此前的研究中，我们利用图位克隆技术初步获得了甘蓝枯萎病抗性候选基因FOC1。在本项目中，我们针对FOC1的功能、分子机制、调控网络等进行了挖掘分析，并在育种应用方面取得了进展。首先，利用转化和敲除试验验证了甘蓝抗枯萎病基因FOC1的功能：FOC1转入感病材料后显著增强了抗性，CRISPR/Cas9介导的FOC1敲除后抗性完全丧失。第二，利用生信分析、亚细胞定位、时空表达、自然变异、进化分析等手段明确了FOC1的特征特性：FOC1为TIR-NB-LRR类型抗性基因，定位在细胞核，在根茎叶中均有表达，且在接种后12小时的根中表达量最高；自然变异分析显示抗性基因FOC1序列高度保守，而感病等位基因foc1变异丰富，进化分析显示与FOC1同源性较高的基因全部为功能未解析的预测基因。第三，利用转录组、酵母双杂、激素处理等手段挖掘出FOC1介导的抗性应答反应密切相关的抗性因子和互作因子，完善了其分子调控网络：转录组分析表明JA、ABA等植物激素信号转导通路多个关键基因显著差异表达，酵母双杂筛选获得了JA通路上的候选互作因子JAZ1等，激素处理试验和qRT-PCR进一步验证了JA通路与抗性应答密切相关。最后，基于FOC1序列信息设计的分子标记已在育种中实际应用，育成的新品种田间表现高抗，具有较好的应用前景。上述研究结果在理论层面上丰富了我们对植物抗性基因功能和调控机理的理解，为深入解析FOC1的抗性分子机制及与病原互作的分子机制提供了重要参考，在应用方面育成的抗性品种可应对生产中的重大病害，保障稳产。