藻栖内共生真菌抑制赤潮藻的活性物质分离、鉴定与抑藻机理研究

赤潮频发，危害严重，发展新型高效且环境友好的赤潮微藻抑制剂是人们关注的热点之一。海洋藻栖内共生真菌生境特殊，其次生代谢产物结构丰富，新颖结构多，在开发活性物质方面前景广阔，但目前从中分离抑制赤潮微藻的研究较少。本研究拟从山东省沿海采集大型海藻，分离并培养内共生真菌，对其次生代谢产物进行分离、鉴定，从中筛选出具有高效抑制赤潮微藻的活性物质。同时，本研究通过考察各活性单体化合物对亚历山大藻、赤潮异湾藻、东海原甲藻和海洋卡盾藻等四种赤潮藻的形态结构、生长速率、抗逆酶活性、抗逆物质含量等生理生化因子的影响，初步探讨这些化合物的抑藻机理。本项目将初步建立起山东省海洋藻栖内共生真菌种质资源库，从其次生代谢产物中分离、鉴定具有高效抑制赤潮微藻活性的物质，并初步揭示这些活性物质的抑藻机理。本项目能为发展新型的赤潮微藻抑藻剂提供有力支持，同时也将丰富藻栖内共生真菌次生代谢产物的研究。

本项目分离获得了100株大型海藻内共生真菌。利用96孔板法，研究了其次生代谢产物的总粗提物对赤潮藻亚历山大藻（Alexandrium sp.）、赤潮异湾藻（Heterosigma akashiwo）、东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）和海洋卡盾藻（Chattonella marina）的抑制活性，筛选出了具有较高抑藻活性的菌株4株（PT20、CF42、PT1和DL29）。. 发酵放大这4株菌株，收集其次生代谢的总提取物，经反复硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、半制备HPLC分离、重结晶，分离纯化得到了单体化合物。综合运用现代波谱技术（IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HMQC、HMBC）、化学方法及已报道的文献确定各单体化合物的结构。共分离获得了60个单体化合物，其中有12个为新颖结构。.本项目检测了这60种单体化合物的抑藻活性进行，筛选出了10个具有较高抑藻活性的单体化合物（1,5-dihydroxy-3-methoxy-7-methylanthraquinone，3β,5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-diene，(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-3β,5α, 6β-triol，opiobolin V，ergosterol，6,8-di-O-methylnidurufin，aversin，6,8-di-O-methylaverufin，alatinone，Ustusolate D）。. 研究了活性化合物1,5-dihydroxy-3-methoxy-7-methylanthraquinone对赤潮藻（赤潮异湾藻和海洋卡盾藻）的形态结构、生长状况和生理过程的影响，初步探讨了其抑藻机理。结果表明，该化合物能损坏细胞膜的完整性，降低叶绿素含量，使赤潮藻细胞的生长速率下降；在该化合物作用下，赤潮藻的可溶性蛋白质的含量升高，抗逆酶POD的活力及丙二醛MDA含量随加入化合物的剂量的增加而增加，而SOD活力则呈相反趋势。