MBL通过MASPs在IR条件下肠粘膜炎症性损伤调控中的作用机制研究

Inflammation after gastrointestinal ischemia-reperfusion play an important role in causing intestinal mucosa damage. Recent studies have found that both MBL and MASP1、MASP2 expressed on the intestinal mucosa， and were increased after the ischemia-reperfusion injury. However，And the intestinal injury and infammatory infiltration was attenuated after the MBL knockout. Thus we speculate that MBL was activated after intestinal I/R, which involoved in the modulation of intestinal inflammatory infiltration through the activated complement induced by MASP1 or MASP2 pathway. In this study, we will use the IR injury model and an intestinal epithelial cell cultured model, and treated by the synthesis rMBL and LPS stimulation. The RNAi technology, Western blot, RT-PCR, ELISA and immune scattering turbidimetry, laser confocal technologies to detect the changes of MBL expression after IR, and MASP1 or MASP2 konckout model will be used to determine the pathway by which the complements activation was affected. The intestinal inflammatory infiltration and the release of inflammatory mediators will be detected to investigate the the role of MBL pathway on regulating the inflammatory damage in the intestinal mucosa after IR injury. This study will help to explain the mechanisms of intestinal mucosa damage after the intestinal IR.

炎症失控是缺血再灌注（IR）损伤的重要病理过程，在肠屏障损伤中起重要作用。近来研究发现：肠IR条件下甘露糖集合凝集素MBL与MASP1、MASP2在肠粘膜同步高表达，并且与IR损伤正相关，而敲除MBL可明显缓解肠道组织损伤和炎细胞浸润。由此我们推测：IR条件下肠粘膜MBL通路激活，通过下游MASP1或MASP2通路激活相应的补体分子，参与对肠道炎症反应的激活和调控。本研究将利用肠道IR损伤模型及体外肠上皮细胞培养模型，给予合成rMBL和LPS刺激，结合RNAi技术、western blot、RT-PCR、ELISA、免疫散射比浊法、激光共聚焦等技术，检测IR条件下肠粘膜MBL通路表达的变化，研究不同MASP分子分别敲除后补体分子的改变，以及对肠道炎细胞浸润和炎症介质释放的影响，探索MBL通过其下游MASPs激活的补体通路在调控肠粘膜炎症性损伤中的作用，为肠屏障损伤机制研究寻求新的分子靶点。

背景：肠道的防御功能是以肠道的屏障功能为主，其中机械屏障和免疫屏障为主构成的肠道黏膜是维持肠道内环境稳态的核心，炎症性肠病(IBD)、全胃肠外营养(TPN)等病理条件下均可导致肠黏膜屏障功能障碍，增加肠道通透性，引发肠源性感染，导致原发疾病加重，最终导致多器官功能衰竭。既往研究提示MBL与肠黏膜屏障密切相关，但具体机制不清。本课题拟通过体内体外实验，应用western blotting、real-timePCR、免疫荧光、跨上皮电阻测定等技术，探讨内毒素条件下MBL通过何种方式参与调控肠屏障功能，并探讨其中作用机制，为MBL缺陷患者肠道保护提供新思路。.方法：1.建立小鼠内毒素血症模型，应用免疫荧光、HE染色、Ussing Chamer技术，观察肠黏膜损伤情况。2.围绕内毒素模型，应用免疫组化，荧光定量PCR，免疫印迹法等技术，观察内毒素刺激后MBL表达情况。3.通过构建MBL干扰质粒，应用免疫印迹法，荧光定量PCR，免疫荧光，TER等技术，观察肠上皮屏障功能的变化情况。4.体外给予不同浓度重组MBL蛋白刺激后，观察上皮细胞损伤以及屏障功能变化情况，明确MBL对上皮细胞的影响。.主要结果：1.LPS处理后，肠黏膜正常形态学改变，绒毛断裂、水肿，上皮细胞脱落，黏膜通透性增加，肠黏膜细胞凋亡增加。2.LPS处理后，体内和体外MBL增多，通过免疫组化发现MBL定位在肠上皮细胞内。3.体外干扰MBL基因后，发现肠上皮细胞间的紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin较正常组表达降低，细胞间紧密连接结构受损，完整性差，连接中断。并且TER显示肠通透性增加。低浓度重组MBL处理Caco-2细胞后，上皮细胞凋亡增加不明显，TJ蛋白表达升高，屏障通透性降低，而高浓度的重组MBL组凋亡明显增加..结论：1.LPS处理肠上皮细胞后，屏障通透性增加，结构受到破坏，凋亡增加，上皮表达MBL增多。同样在体外LPS处理肠上皮细胞后MBL表达也增多，提示MBL的表达可能在调节肠屏障功能中起到重要作用。2.体外干扰MBL基因后，肠上皮紧密连接蛋白表达降低，紧密蛋白结构改变，肠黏膜通透性增加，表明MBL通过调节紧密连接蛋白的表达从而调节肠黏膜屏障功能。而低浓度的重组MBL蛋白可以促进TJ蛋白的表达，起到保护屏障功能。