肝转移相关microRNA miR-199b通过SIRT1/KISS1调节结直肠癌细胞侵袭转移的机制研究

Liver metastasis is one of the most important factors affecting the prognosis of colorectal cancer. Our preliminary data showed that not only miR-199 b is the tissue-specific microRNA of liver metastasis from colorectal cancer, but also miR-199b might regulate the liver metastasis through SIRT1/KISS1 signal passway. However, its the mechanism is unclear. In this study, in situ hybridization and immunohistochemical techniques were used to study the expression of miR-199 b and SIRT1 in colorecgtal cancer tissues and metastatic tissues as well as the relationship between their expressions and the clinical pathological parameters; invasion assay under liver cell imaging system and wound healing assay were used to detect the invasion and shift of colon cancer cells regulated by miR-199b; dual luciferase report system,electrophoretic mobility shift assay and site-directed mutagenesis, co-immunoprecipitation and assay for acetylization and phosphorylation were used to study the the mechanism of miR-199b regualting the invasion and metastasis through SIRT1/KISS1 pathway; carcinoma oncogeneis model and metastasis assay in nude mice were used to verify the mechanism of miR-199b affecting the invasion and metastasis through miR-199b. The research of miR-199b/SIRT1/KISS1 pathway might contribute the new target to the treatmentof liver metastais from colorecgtal cancer.

肝转移是影响结直肠癌预后的重要因素。前期通过miRNA微阵列芯技术、生物信息学预测等筛选鉴定出miR-199b为结直肠癌肝转移的相关miRNA，并可能通过SIRT1/KISS1通路调节结肠癌细胞转移，但其分子机制尚不清楚。本课题拟用免疫组化、原位杂交法探讨结直肠癌组织及肝转移灶中miR-199b及靶基因SIRT1表达与临床病理指标和预后的关系；用活细胞成像侵袭实验、划痕实验等研究miR-199b通过调节SIRT1对结肠癌细胞侵袭迁移能力的影响；通过双荧光素酶、凝胶迁移电泳（EMSA)、定点突变、免疫共沉淀、乙酰化及磷酸化水平鉴定等探索miR-199b通过SIRT1调节KISS1表达影响结直肠癌侵袭转移的分子机制；最后用裸鼠转移实验在动物体内对miR-199b调节结肠癌细胞侵袭转移的机制进行验证。miR-199b/SIRT1/KISS1/信号通路的研究有可能为结直肠癌肝转移治疗提供新靶点。

结直肠癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤。侵袭和转移是影响结直肠癌患者预后的重要因素，肝脏是结直肠癌转移最常见的靶器官，但目前关于结直肠癌发生肝转移的分子机制尚不清楚。前期通过miRNA微阵列芯技术、生物信息学预测等筛选鉴定出miR-199b为结直肠癌肝转移的相关miRNA，并可能通过SIRT1/KISS1通路调节结肠癌细胞转移，但其分子机制尚不清楚。本研究首先发miR-199b、KISS1在结直肠癌组织中显著低表达（P＜0.01）、而SIRT1显著高表达（P＜0.01），且miR-199b与SIRT1在结直肠癌组织中的表达呈明显负相关；MiR-199b低表达结直肠癌患者平均生存时间明显短于高表达患者 [（23.8±3.4）比（36.5±3.8）个月]，差异有统计学意义。过表达miR-199b后，SW620细胞侵袭、迁移能力、克隆形成能力都显著减弱；抑制miR-199b后，SW480细胞侵袭、迁移能力、克隆形成能力都明显增强。进一步分析miR-199b与SIRT1关系，双荧光素酶报告基因实验发现miR-199b与SIRT1 mRNA的3‘UTR的507-513位点结合。干扰SIRT1后，基因芯片显示KISS1蛋白表达明显上调，转录因子预测CREB可能为KISS1的转录因子。免疫共沉淀实验证明SIRT1能与CREB蛋白结合。SIRT1作为去乙酰化酶，是否通过去乙酰化影响CREB仍是未知。进一步干扰SIRT1后发现CREB乙酰化水平增强，过表达SIRT1后，发现磷酸化的CREB表达量显著减少，说明SIRT1通过去乙酰化CREB影响其磷酸化水平进而影响其活性。染色质免疫共沉淀实验发现，用抗CREB抗体行免疫沉淀，用PCR检测KISS1 DNA表达，结果显示在KISS1的-191~-184bp和-1961~-1954bp启动子区，用ChIP实验均能检测到KISS1的表达，说明CREB蛋白确能和KISS1染色质直接作用，双荧光素酶报告基因实验进一步证实CREB蛋白确能和KISS1启动子结合增强KISS1的转录活性。最后，通过结肠癌肝转移模型实验发现经尾静脉注射过表达miR-199b和正常的结肠癌细胞后裸鼠肝转移及肺转移灶明显减少，再次证明miR-199b在动物体内能够抑制结肠癌细胞的远处转移。miR-199b信号通路的研究对探究结直肠癌肝转移的分子机制具有重要意义。