马氏珠母贝同源异型盒基因MSX在壳形成中的功能与调控机制

Pearl oyster Pinctada fucata is an important mariculture shellfish for pearl production, its shell and pearl (nacre) formation is a typical biomineralization process similar to form a tooth and bone. It is speculated that they have similar signaling pathways. The MSX gene belongs to a homeobox gene family, and is an important regulator of dental and skeletal development. In bioinformatics analysis showed that the P. fucata MSX gene is relatively conservative in evolution, and shell matrix protein gene Nacrein promoter contains MSX binding sites.The MSX gene expressed highly in the D-shaped larvea and mantle,which suggests this gene can regulate the shell formation. Based on these information, this program will try to understand the gene structure and expression profiles of pearl oyster MSX gene, its transcriptional regulation on Nacrein gene and regulatory pathway, and its control of the shell formation, thus to identify the function of the MSX gene, and explain its role and mechanism in the shell formation of pearl oyster. The results will help us understand the molecular regulation mechanism of pearl oyster shell and pearl formation, deepen the understanding of the biomineralization of this kind of life phenomenon, and in future provide scientific guidance for the innovation of pearl culture technology.

马氏珠母贝是一种重要的海水养殖贝类和生产珍珠的主要母贝，其贝壳/珍珠（质）的形成是一个与牙齿/骨骼形成类似的典型生物矿化过程，推测它们拥有相近的信号通路。MSX基因属同源异型盒基因家族，是牙齿和骨骼发育的重要调节因子。生物学信息学分析发现马氏珠母贝MSX基因在进化上较保守，壳基质蛋白蛋白基因Nacrein启动子含有MSX的结合位点；而MSX基因在外套膜组织及D-型幼虫期表达量较高，推测其参与壳的形成。基于此，项目拟研究马氏珠母贝MSX基因的结构与表达特性，研究其对Nacrein的转录调控及对壳形成的影响，以及其参与的信号调控通路。从而对该基因的功能进行鉴定，阐释其在珍珠贝贝壳形成中的作用和机理。研究结果将有助于我们深入解析珍珠贝贝壳/珍珠形成的分子调控机制，加深对生物矿化这类生命现象的认识，同时可为珍珠培育技术创新提供科学指导。

马氏珠母贝又称合浦珠母贝，广泛分布于热带和亚热带海区，是世界上海水珍珠培育的主要母贝，也是研究生物矿化的热门对象之一。目前关于贝类生物矿化分子机理的研究主要为基质蛋白的克隆与功能分析，而对基质蛋白的调控研究还很少。项目对马氏珠母贝MSX和GEP等对贝壳矿化过程的调控机理进行研究，将有助于我们逐步解析和认识珍珠贝的生物矿化形成和调控机制。.1、克隆了一个同源异形盒家族成员——MSX基因（PfMSX）。组织表达分析表明，PfMSX mRNA在消化腺、外套膜、性腺、闭壳肌、心、鳃组织中均表达，外套膜表达量最高；在不同的发育时期，PfMSX mRNA在D型幼虫表达量最高。亚细胞定位结果显示PfMSX定位于细胞核中。EMSA实验证实了PfMSX可以结合到Pif启动子上的MSX绑定位点。双荧光素酶报告基因实验结果表明PfMSX可以激活Pif启动子，同时也表明了PfMSX激活Pif启动子主要通过MSX绑定位点1（MBS-1）而不是MSX绑定位点2（MBS-2）起作用。RNA干扰结果发现PfMSX和Pif的mRNA水平都有显著下降， PfMSX基因干扰后的珍珠层晶体的数量变得稀少，而且六边形的晶体结构有向棱形变化趋势。.2、扩增出马氏珠母贝GEP基因三种不同剪切体：PfGEP-1，PfGEP-2和PfGEP-3。PfGEP-1和PfGEP-3 mRNA在不同组织和发育时期有广泛表达。 PfGEP基因RNA干扰后，PfGEP-1和PfGEP-3 mRNA水平都有显著下降，珍珠层晶体的数量变得稀少，而且六边形的晶体结构有向棱形变化趋势，同时，PfMSX基因的表达量分别下降了大约70%，初步验证了PfMSX可能是PfGEP下游的因子。双荧光素酶报告基因实验结果表明PfGEP-1和PfGEP-3可以调节PfMSX的活性。并存在GEP-MSX信号通路，从而参与壳的生物矿化过程。.3、PfSMAD4在各种组织均有表达，其中卵巢表达量最高；在不同发育时期，D型幼虫表达量最高。RNA干扰实验表明，dsSMAD4可引起SMAD表达下降，dsBMP2可引起BMP2和SMAD4表达下降，并引起壳晶体结构变得无序；同时，双荧光素酶报告基因系统检测表明，BMP2可激活SMAD4基因启动子。双分子荧光互补(BiFC)技术表明PfSMAD4可以与PfMSX相互作用。