生地大黄汤对脑出血大鼠小胶质细胞的双向调节作用研究

Shengdi-Dahuang Decoction, firstly recorded in "Qian Jin Yi Fang", has been widely used in hemorrhagic disease for thousands of years. Lots of clinical and preclinical studies found that Shengdi-Dahuang Decoction can promote the absorption of hematoma after intracerebral hemorrhage (ICH) and improve neurologic function recovery. The mechanisms may be related to the dual role of microglia in intracerebral hemorrhage. In the early stage of ICH, microglia are activated rapidly, resulting in inflammatory toxicity; a few days later, they play an important role in the process of phagocytosis of the deposited blood as well as damaged and dead tissue, which helps hematoma resolution. Based on the latest researches on ICH and our previous work, we believe that from 1 hour to 3 days after ICH onset, microglia are mainly activated to mediate inflammatory reaction, activate TLR4/NF-κB signaling pathway, and release pro-inflammatory cytokines, resulting in inflammatory toxicity; afterwards phagocytosis starts by activated microglia through upregulation of CD36 activation. Shengdi-Dahuang Decoction has bidirectional regulation on microglia in rats after ICH. It can inhibit inflammatory toxicity in the early stage, and promote the absorption of hematoma later. Collagenase infused into the basal ganglia of rats is used to establish animal models of ICH. Neurologic function scores, hematoma volumes, number of activated microglia, expression of CD36, TLR4, NF-κB, TNF-α and IL-1β are observed in different time points.

生地大黄汤出自《千金翼方》，千余年来广泛用于出血性疾病。大量的临床和基础研究发现生地大黄汤能促进脑出血后血肿吸收和神经功能的改善，作用机制可能与其对脑出血后小胶质细胞介导的双重作用有关。在脑出血早期阶段，小胶质细胞迅速激活，产生炎症毒性；数天后它可以通过吞噬作用清除血肿。在总结脑出血神经病学研究进展及我们前期工作的基础上，我们认为脑出后1小时到3天内，激活的小胶质细胞主要介导炎症反应，激活TLR4/NF-κB信号通路，释放促炎细胞因子，产生炎症毒性；此后血肿成分通过上调CD36，激活小胶质细胞启动吞噬功能，促进血肿消散。生地大黄汤对脑出血后大鼠的小胶质细胞有双向调节作用，前期抑制炎症反应，后期促进血肿吸收。我们拟将胶原酶注入大鼠基底节，建立脑出血动物模型，观察不同时间点神经功能评分、血肿体积、小胶质细胞活化数量和CD36、TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达水平，验证该假说。

脑出血是一种高发病率、高致死率、高致残率的疾病，目前的研究多集中在出血后的二次损伤。小胶质细胞在脑出血后发挥着重要作用，一方面，活化的小胶质细胞通过吞噬作用清除血肿和受损的细胞碎片；另一方面，过度活化的小胶质细胞释放多种细胞因子；自由基、一氧化氮等有毒化学物质，从而加重脑出血引起的脑损伤。研究发现，小胶质细胞可分化成不同的表型发挥不同的作用——M1型主要发挥促炎、细胞毒性等作用，M2型主要发挥吞噬、保护等作用。M1型小胶质细胞相关蛋白包括iNOS、CD11b、CD16、CD32和CD86等，活化的M1型小胶质细胞可通过激活TLR4/NF-κB信号通路，导致促炎性细胞因子如TNF-α和IL-1β的上调，并导致脑损伤。M2型小胶质细胞相关蛋白包括CD206, Arg-1, Ym-1/2, IL-4，IL-10等。研究表明，脑出血后， M1到M2表型在7天内发生转换，但表型改变的确切时间尚不知道。生地大黄汤生地大黄汤出自《千金翼方》，药仅生地黄、大黄二味，治疗出血性疾病颇有疗效，其立方药简意深，配伍精当，我们的前期研究已表明，它可通过提高神经细胞的功能活性，促进其修复，对出血性脑卒中患者和脑出血大鼠的神经保护作用具有重要意义。本实验采用胶原酶诱导大鼠基底节出血模型，随机分为假手术组、模型组和生地大黄汤组，在不同时间点检测神经功能、脑含水量、出血量、TLR4/NF-κB信号通路表达、TNF-α和IL-1β水平、iNOS及Arg1表达、IL-4和IL-10水平。本研究证实，M1和M2型小胶质细胞转换的时间点可能在第3天，M1型小胶质细胞在第3天达到峰值，随后逐渐减少，而M2型小胶质细胞逐渐增加。生地大黄汤可通过抑制M1型小胶质细胞的表达，下调TLR4/NF-κB信号通路，减少TNF-α和IL-1β表达，减轻脑水肿，及其表达的炎症因子，减轻水肿；同时增加M2型小胶质细胞的表达，加强其吞噬功能，起到双向调节的神经保护作用。研究结果为脑出血急性期临床治疗提供了新思路。