斜纹夜蛾核型多角体病毒II的三个早期转录基因的功能鉴定

斜纹夜蛾属鳞翅目夜蛾科，危害的植物达 99 科 290多种，该虫严重危害水稻、玉米、棉花、烟草、花生、蔬菜等作物和花卉、草坪等观赏植物，而杆状病毒是控制该种害虫的有效方法，已得到大面积生产应用。我们测定了对该害虫已知杀虫效果最佳的杆状病毒的全基因组序列，发现为一新的病毒，命名为斜纹夜蛾核型多角体病毒II，并对其病毒的组成蛋白进行了分析。根据下述标准：在Maldi-tof分析中有很高的覆盖率、启动子分析表明具有很强的早期启动子活力、病毒感染后的mRNA拷贝数较高、在模式病毒种AcMNPV等没有发现同源物或一致性较低且功能不明确的，选择其基因组中的ORF6、ORF50、ORF57等基因进一步进行病毒基因组中的ORF敲除或拯救、免疫组化、启动子功能分析等试验，以期阐明上述基因的功能，加深对杆状病毒基因组的结构和功能的了解。

在完成SpltMNPVⅡ的全基因组序列测定的基础上，用二级质谱分析方法对SpltMNPVⅡ BV和ODV的组成蛋白进行了研究，确定了SpltMNPVⅡ BV由42种蛋白组成，SpltMNPVⅡ ODV由46种蛋白组成。在此基础上首先进行了9个基因（7个早期基因：ORF50、ORF57、ORF63、ORF6、ORF13和ORF146，两个晚期基因：ORF117和ORF29），的功能研究，对上述基因进行了启动子活性分析、荧光定量PCR技术的基因转录时相调查、抗体制备、Western分析、蛋白质细胞定位的研究。ORF50在病毒感染2 h后开始转录表达，且在SpltNPVⅡ的BV中的含量要远高于在ODV中，推测ORF50可能与BV在虫体内对周围细胞的感染有着重要作用；ORF57转录时相的分析，推测其在病毒的BV和ODV复制期间存在着相应的表达高峰，推测其与病毒的复制相关，原核基因表达结果初步表明ORF57基因编码的蛋白可能同时具有多聚核苷酸激酶和3’磷酸酶活性；ORF63在病毒感染4-12h稳定转录，18h达到转录高峰，24h以后转录水平略有下降，但趋于稳定。感染细胞定位实验表明ORF63基因产物在细胞内的出现可能是一个从早期细胞核定位到晚期细胞质膜定位的一个动态过程，可能与病毒粒子的形成相关；ORF117和ORF29因为无论其mRNA和蛋白质在病毒感染的晚期一直持续表达，而且在感染细胞内的定位主要在细胞质中，结合质谱分析结果表明上述两种蛋白可能是病毒粒子的结构蛋白；对SpltMNPVⅡORF6、ORF13和ORF146基因的表达时相分析表明它们在病毒感染的早期就有表达，但它们对病毒反式因子的作用模式各不相同，因此它们在病毒基因组中扮演不同的功能。确定了SpltNPVⅡ的7个hrs均具有基因组DNA复制起始点和增强子的双功能作用，DNA复制效率与重复序列序列数目的相关性最高，增强子能力与特征motif序列数的相关性最高，均达极显著水平；病毒DNA甲基化研究表明该病毒基因组有甲基化现象存在，有相应高甲基化和不甲基化区段现象；对SpltNPVII Bacmid和Bm NPV Bacmid的构建进行了大量工作，并对存在的问题进行了讨论。本课题共发表相关论文10篇，其中SCI论文3篇；获得授权国家发明专利两项，申请一项，其中两项发明已被公司用于新产品开发，获得全国性学会优秀论文奖。