大豆种子特异表达启动子的克隆及其功能研究

种子中的营养成分是植物基因工程改良的重要目标，种子特异表达启动子驱动基因在种子中专一性表达。利用高效特异性强的种子特异表达启动子可以按照人们的意愿改进及提高种子中营养物质含量。种子特异表达启动子的克隆及其功能研究能为目的基因在种子中的高效表达提供保障。大豆种子中富含蛋白和脂类，本研究根据大豆种子中特异表达的基因及比较其他植物中已有的种子特异表达的启动子及基因，采用TAIL-PCR 和 接头-PCR 法克隆大豆中天冬氨酸蛋白酶，硬脂酰-ACP脱饱和酶，酰基载体蛋白硫酯酶及抗氧化剂四个基因的启动子，将其构建在含有GUS基因的表达载体中，用其转化拟南芥和大豆，通过GUS基因在拟南芥和大豆中的表达，确定其种子特异表达的特性，并对种子特异启动子进行缺失等功能研究，探明启动子的调控元件和调控方式，进而对克隆的启动子进行定向改造，最终获得高效特异性强的种子特异表达启动子，为植物基因工程研究提供有效工具。

依托该项目发表论文23篇，其中4篇SCI、19篇核心期刊；申请专利6项、已授权2项；培养研究生7名，其中，博士2名、硕士5名。超额完成了项目合同指标。. 本研究利用TAIL-PCR或PCR的方法克隆大豆中种子特异表达基因的5‘端上游序列，克隆了天冬氨酸蛋白酶（SAP）和硬脂酰-ACP脱饱和酶（ACP）2个在种子中特异表达的启动子，其启动活性与35s相近。对克隆的种子特异表达基因的启动子进行鉴定，同时对其主要调控区域进行分析研究，为明确种子特异启动子的调控机制提供依据，为大豆转基因工程研究、应用提供有利工具。. 研究得到以下结果：（1）在SAP1和SAP2 的转基因拟南芥的根、茎、叶、花、角果壁中没有检测GUS活性，在种子中检测到GUS活性，说明SAP1和SAP2具有种子特异表达特性；在SAP3的转基因拟南芥的根、茎、叶中没有检测到GUS活性，在花、角果壁和种子中检测到GUS活性，说明SAP3驱动下游基因在花、角果壁和种子中表达，不具有种子特异表达特性，推测SAP2和SAP3（-356~-157）区域存在与种子特异表达相关的正调控元件；（2）SAP4转基因拟南芥种子中的GUS活性较SAP3转基因拟南芥种子中的GUS活性显著下降，说明SAP3和SAP4（-157~-34）区域对soyAP1基因启动子驱动下游基因在种子中具有活性很重要。（3）SAP5、SAP6和SAP1驱动GUS基因在转基因拟南芥种子中的表达活性依次增强，说明内含子的存在能够增强启动子的表达强度。研究中确定SAP1启动子具有种子特异表达特性且表达活性与CaMV35S启动子相近，可用于大豆转基因研究中。（4）SAC-Cp、 SAC-Cp1和SAC-Cp2具有较强的种子特异表达特性；SAC-Cp3能够驱动下游基因在根、茎和叶中表达，种子特异表达特性有所减弱，推测SAC-Cp2和SAC-Cp3（-1526bp~-1060bp）区域内存在种子特异表达正调控元件。（5）与SAC-Cp4相比，SAC-Cp5在各个组织中表达量都比较低，已经不具备启动子活性，故SAC-Cp4和SAC-Cp5（-433bp~-61bp）区域对启动子的非常重要的。（6）与SAC-Cp3相比，SAC-Cp4表达量有所下降，说明SAC-Cp3和SAC-Cp4(-1059bp~-434bp)区域内可能含有相关顺式作用元件。