寡核苷酸介导的DNA组装方法的开发及其在代谢工程中的应用

The rapid and efficient assemble and optimization of multi-step metabolic pathway method is essential for metabolic engineering, and also a significant challenge in synthetic biology. Since imbalances in gene expression of a metabolic pathway usually result in fewer yields of the desired products, a new strategy of metabolic engineering is to optimize metabolic fluxes by employing synthetic biology tools. In this project, we aim to develop a rapid and efficient assembly of multiple DNA fragments using the oligonucleotides linkers-mediated approach (OLMA). The assembly process can easily incorporate multiple gene variants, user-defined gene order and diverse expression levels with reducing the inefficient mutants, allowing to rapidly construct and optimize metabolic pathways. We attempt to optimize productivity of crtEBI pathway using the approach, and investigate the applications of the method for metabolic engineering.

快速有效的DNA组装和优化多步骤的代谢通路的方法是目前代谢工程领域必不可少的一个环节，也是合成生物学的一个重要挑战。在多基因的代谢通路中，各个酶的不平衡表达往往会带来目标产物合成能力的低下。随着合成生物学的发展，应用合成生物学工具来组装和优化代谢通路多个基因的合理协同表达，提高合成途径效率是目前代谢工程的一个新的策略。本项目拟开发一种快速有效的多片段组装方法（OLMA）来对生物合成代谢通路进行多元件的组装和组合优化(从多种来源基因，同一操纵子基因顺序，不同强度的基因表达水平)，实现代谢通路的多基因的平衡表达。我们拟将该方法应用到番茄红素的crtEBI 合成途径优化上，通过该方法提高番茄红素的产量，测试该方法在代谢工程的应用性。

在代谢工程中，调整酶的表达量是优化代谢途径、提高原料转化率和产品产量的重要方法。酶的表达量可以通过改变载体拷贝数、启动子强度、RBS强度、相应基因在操纵子中的位置以及同工酶替换等策略来实现，而先前的优化方法大多集中于对单一位点进行突变或重组建库，而无法兼顾构成代谢途径的多种酶间的表达平衡。为了解决这一问题，需要实现对多个位点的同时变换，为此我们开发了基于Golden gate DNA组装法的OLMA法，该方法可以一步法重组最多八个元件，可实现在多个层次、对多个靶点的同时建库，且避免了传统方法中由于经过多轮PCR而导致的意外突变的引入。应用OLMA法，我们（1）一次性组装了多个片段的lacZ 表达盒；（2）针对lycopene合成途径中的四个关键酶crtE、crtB、crtI和idi设计了RBS库、基因来源种类库和不同的基因排列，在一个反应体系中混合组装并转化后，成功获得了基因型和表现型都具有显著多样性的重组文库。