特异性定位的小分子荧光探针的合成及其在蛋白质分析中的应用

本项目是针对当前氨基酸与蛋白质荧光检测分析研究中的关键科学问题而提出，旨在建立和发展以非共价标记为作用基础的高精度和高灵敏度的氨基酸与蛋白质的荧光定量方法，实现对特定氨基酸或蛋白质快速，准确的定位与定量。拟采用量子计算化学、现代有机合成、蛋白质分析化学等多学科交叉的方式，通过本项目的实施，争取获得若干具有优良性能的氨基酸与蛋白质的荧光探针（探针的荧光性能、溶解性、选择性、灵敏性、作用机理是考察重点），实现对某些重要蛋白质（血清蛋白、锌指蛋白）的荧光定位与定量检测，提供对特定生物分子新的标记与检测方法。

通过本项目四年的详细系统的研究，我们提出了一种基于非共价键作用的蛋白质标记与分析方法，已达到预期的研究目标。我们设计合成了一系列的小分子探针。其中CT-1-Zn在所测试20种天然氨基酸中，对精氨酸（Arg）表现出了特异性的识别。通过对照实验，我们推测探针CT-1-Zn的冠醚部分与三联吡啶配合物部分分别与Arg的胍基残基以及羧基之间发生了相互作用。对于此推论，我们用量子化学的手段进行了验证。我们进一步利用紫外与荧光光谱研究了CT-1-Zn与牛血清白蛋白（BSA）的相互作用。结果表明，CT-1-Zn作用于BSA分子的第一结合位点上的Arg218，并且与Trp214之间发生了荧光共振能量转移(FRET)。为此，我们利用Autodock等量子化学方法对小分子探针与蛋白质的作用方式进行了模拟验证。在此基础上，我们选取了两种不同的细胞系（HSC细胞与RAW264细胞），对探针分子CT-1-Zn的细胞膜通透性进行了考察。激光共聚焦实验结果表明，探针CT-1-Zn在细胞培养液中与细胞共同孵育半小时后，在荧光显微镜下即可观察到明亮的绿色荧光发射。这些数据表明探针CT-1-Zn具有较好的细胞膜通透性。其次，对探针分子CT-1-Zn的细胞毒性进行了考察。在较低的浓度范围内（0-1mg/mL）， 探针CT-1-Zn的加入没有给细胞的存活率带来显著的影响，证明在低浓度下，探针CT-1-Zn具有较小的细胞毒性。当探针CT-1-Zn的浓度高于2mg/mL时，探针CT表现出了一定的细胞毒性，其细胞致死率约为15%。最后，利用探针CT-1-Zn，对BSA的细胞转运功能进行了探讨。在同等浓度的条件下，与对照组相比，加入BSA后，其荧光强度明显增强，表明BSA的加入增加 了进入细胞内部探针CT的量。接下来，为了定量的分析BSA的作用，我们对细胞进行了破碎分离，然后利用光谱法对细胞内的探针CT-1-Zn的含量进行了定量的检测。结果表明，加入BSA后细胞内探针CT-1-Zn的荧光强度比对照组的荧光强度增强了约4.47倍。这些实验数据再次证明了探针分子CT-1-Zn与BSA是通过非共价键的方式相结合。BSA的加入有效的促进了细胞对探针分子CT-1-Zn的摄入量，这也证明了HSC与RAW264细胞膜上可能存在着BSA的结合位点