肾脏发育相关基因IGF2和WT1 DNA甲基化与宫内发育迟缓的关系研究

宫内环境不仅可以导致宫内发育迟缓（IUGR），而且可以通过"发育程序化"途径对机体各器官结构和功能产生长期以至终生的影响，其中也明显增加了生后发生蛋白尿和终末期肾脏疾病的风险。我们前期研究发现IGF2和WT1可能是IUGR引起生后肾小球数目减少等肾脏病变的重要分子，并且已有研究发现这些基因的表达可能与DNA甲基化密切相关。本研究拟通过已建立的SD大鼠IUGR模型，应用甲基化特异性PCR技术观察宫内环境对肾脏及足细胞IGF2和WT1基因启动子CpG岛甲基化状态的影响，以及这些基因甲基化状态与肾脏和足细胞功能的相关性，探讨宫内环境引发生后肾脏疾病的可能分子机制及寻找胎儿来源肾脏疾病的治疗靶标；同时研究尿沉淀细胞DNA甲基化的状态，探讨从尿液中寻求关键早期诊断标志的可能性与可行性，为今后胎儿来源肾脏疾病的早期发现和监测提供实验依据。

[目的]本研究拟选用孕期全程低蛋白饮食法建立IUGR大鼠模型，动态观察IUGR对大鼠肾脏结构和功能的影响，肾脏WT1和IGF2 DNA甲基化水平和DNA甲基化酶的表达变化，以及尿沉淀细胞中microRNA的差异表达，探讨IUGR大鼠WT1和IGF2 DNA甲基化与肾脏发育和功能的关系。[方法]选择新生期、生后4周和生后12周作为研究节点，Real-time PCR方法检测肾脏WT1和IGF2 mRNA水平以及甲基化转移酶mRNA水平；MassARRAY方法检测基因启动子区DNA甲基化状态。并对IUGR大鼠进行生后营养干预，检测肾功能及肾脏WT1和IGF2 DNA甲基化水平和DNA甲基化酶的表达变化。采用miRCURY™ LNA Array (v.18.0)芯片筛选12周龄时IUGR大鼠尿沉淀细胞中差异表达的microRNA，并进行验证。[结果] IUGR大鼠单侧肾脏肾小球数目下降了约21%；在8周龄时出现高血压，12周龄时出现了轻度的蛋白尿。IUGR新生鼠肾脏皮质区较薄，生肾区占总皮质区厚度的百分比增高；12周龄时，肾小球细胞外基质增多，电镜显示存在少量足细胞融合。IUGR大鼠生后，WT1基因启动子区的甲基化水平呈现先增高后降低的动态变化，而IGF2基因的启动子区未发生明显甲基化改变；新生期时，DNMT1和DNMT3a的表达明显升高，并与WT1基因DNA甲基化水平呈线性相关；成年期后，DNMT1和DNMT3b也出现了明显降低。IUGR大鼠生后给予营养干预，肾脏WT1基因的甲基化水平均显著降低，12周龄时，甲基化水平已显著低于生后正常喂养IUGR组，这与WT1 mRNA高表达呈明显的线性关系。IUGR大鼠尿液中3倍以上差异表达的microRNA上调的有17个，下调的有30个。在IUGR大鼠尿液及肾组织中，miR-185表达均较对照组增高，与芯片结果一致，且其表达与肾组织中DNMT1的表达显著相关。[结论] 不良的宫内环境可影响WT1 的甲基化状态，继而导致其异常表达，而不同发育阶段WT1 和IGF2的异常表达参与了IUGR大鼠肾小球减少和成年期蛋白尿的发生。DNMT1是参与调控是参与调控WT1甲基化改变的重要甲基化酶。生后高蛋白喂养可通过改变启动子区甲基化状态调节WT1的异常表达，从而造成肾脏损伤。尿液miR-185的检测可能作为IUGR所致肾损害的一种早期筛查指标。