海洋放线菌源次生代谢产物Cyanogrisides生物合成后修饰酶的功能研究

The secondary metabolites produced by marine microorganisms often have unique, novel and complex chemical structure, which provided materials for exploring novel enzymatic mechanisms. Cyanogrisides were isolated from a marine-derived Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6 with numerous analogues.Cyanogrisides bears a unique 2,2'-bipyridine structure ,unusnal oxime functionality and a novel cyclic glycoside and shows moderate cytotoxicity.In previous study, We have cloned the gene cluster responsible for caerulomycin A biosynthesis from strain WH1-2212-6. The aim of this proiect is to clone and identify the post-tailoring enzyme for the biosynthesis of cyanogrisides, which are glycosidic derivatives of caerulomycins. The project intends to carry out the following studies:(1) cloning and identification gene cluster and key enzymes for sugar biosynthesis of cyanogidises; (2)identification the function of left post-tailing enzyme for oxmie group; (3) Using of combinational biosynthesis technology to get more cyanogriside analogues.

海洋微生物次级代谢产物往往具有独特、新颖和复杂的化学结构，为发掘新颖酶学机理提供了良好的材料。从自主分离的海洋异壁放线菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6中分离鉴定到一系列浅蓝霉素家族同系物Cyanogrisides，该类化合物具有独特的二联吡啶、肟基侧链和糖基修饰结构，有很好的抗肿瘤活性。前期的研究中，本课题组从菌株WH1-2216-6中克隆鉴定了浅蓝霉素A生物合成基因簇，本项目拟在此基础上，开展Cyanogrisides生物合成后修饰酶的功能研究，主要包括以下内容：（1）克隆Cyanogrisides结构中糖合成相关的基因簇，鉴定糖基转移酶,半缩酮形成酶等后修饰酶的功能；（2）鉴定肟基侧链形成相关的后修饰酶的功能；（3）在鉴定酶功能的基础上开展组合生物合成研究，以期获得更多的Cyanogrisides新结构衍生物。

Cyanogrisides分离自海洋异壁放线菌Actinoalloteichus cyanogriseus WH1-2216-6，属于浅蓝霉素家族，具有很好的抗肿瘤活性，在前期研究的基础上，本研究主要对后修饰合成机制开展了研究，包括通过体内基因缺失，体外生化，晶体结构解析，阐明了氨基转移酶CrmG催化的“乒乓转氨机制”，黄素氧化酶CrmK催化的羟基变羧基机制，结合酶动力学数据分析阐明了一种次级代谢产物中少见的底物补偿机制。.具体表现为：由于氨基转移酶催化机制的特征（乒乓机制），注定了CrmG催化的转氨过程进行的比较缓慢，而其底物CRM M含有的醛基会作为亲电子基团与细胞内含有硫醇、胺类等蛋白发生加成生成复合物而产生毒性，因此在细胞内不能大量累积，多余的CRM M会被自发的还原为含羟基的副产物CRM P，氧化酶CrmK的存在可以将副产物CRM P在重新回补到主途径中，同时又避免了过度氧化，因此通过CrmG和CrmK的功能鉴定阐述了一种次级代谢产物生物合成中底物补给和重利用体系，这在次级代谢产物生物合成中罕见报道。