铁通过SHH/FOXF1/ATX轴调控肺间充质细胞增殖及肺纤维化的机制研究

The proliferation and fibrotic differentiation of lung mesenchymal cells (MCs) are key factors leading to pulmonary fibrosis (PF). The accumulation of iron in the lungs of patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) suggests that iron is involved in the PF process, but the specific role and mechanism are unclear. Preliminary data showed that the levels of iron and Ferritin in pulmonary macrophages (MACs) and MCs increased in the BLM-induced mouse PF model, and iron chelators inhibited the PF progression. SHH, a signaling protein highly expressed in pulmonary MACs, decreased significantly in pulmonary MACs of mice with PF. This project aims to analyze the changes of iron metabolism in pulmonary MACs and lung MCs during PF by combining the BLM-induced PF mouse model and the cell experiments in vitro, to clarify the effects of iron on PF, and to further confirm the regulatory mechanism of iron on the proliferation of pulmonary MCs and pulmonary fibrosis through SHH/FOXF1/ATX axis. We hope to provide potential new targets and theoretical basis for the development of effective treatment strategies for PF.

肺间充质细胞（Mesenchymal cells，MCs）的增殖和纤维性分化是导致肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）的关键。特发性肺纤维化患者肺铁累积，提示铁参与了PF过程，但铁的具体作用及机制不明。预实验显示，博莱霉素（Bleomycin，BLM）致小鼠PF模型中，肺巨噬细胞（Macrophages，MACs）和MCs中铁和铁蛋白水平升高，铁螯合剂抑制PF进程，肺MACs高表达的信号蛋白SHH在PF模型中却显著降低。本项目拟通过BLM致小鼠PF模型及体外细胞实验，解析PF过程中肺MACs和肺MCs的铁代谢随时间变化，并明确铁对PF的作用，进一步通过肺泡MACs经SHH对肺MCs增殖调控作用的研究，证实铁经SHH/FOXF1/ATX轴调控肺MCs增殖与肺纤维化进程机制。期望为发展PF有效的治疗策略提供潜在新靶点和理论依据。

肺纤维化（PF）以慢性、进行性大量细胞外基质聚集从而造成肺结构破坏和功能下降为特征。PF进程中铁代谢失调，但是铁参与PF的致病机理和信号通路不清楚，且目前尚无能够有效治愈或逆转已发生PF的治疗策略或药物。本项目采用博莱霉素（Bleomycin，BLM）致小鼠PF模型、tfr1突变体小鼠、肺原代成纤维细胞、巨噬细胞肺等材料，解析了PF进程中肺巨噬细胞（MACs)和肺间充质细胞（MCs）铁代谢随时间变化特征，明确了铁对PF的促进作用，并研究了铁调控肺MCs增殖的信号通路。主要结果和结论包括：（1）肺铁及肺MACs和肺MCs中铁代谢在博莱霉素致肺纤维化模型构建后第1天即开始发生失调，在大约第10-14天到达高峰，之后持续伴随肺纤维化的整个生成过程。主要表现为铁血黄素累积或铁水平升高，铁蛋白表达升高，Dmt1和Tfr1表达降低，Fpn1表达升高。（2）铁水平对肺纤维化进程具有正调控作用：铁螯合剂如氯碘羟喹抑制肺纤维化程度，补铁剂如FAC加重肺纤维化程度；BLM致tfr1+/-肺纤维化小鼠较野生型小鼠的肺铁水平降低且肺纤维化程度减轻。（3）高铁和低铁处理BLM致肺纤维化小鼠分别提高和降低了肺MCs的数量。细胞共培养体系中，高铁和低铁分别促进和抑制巨噬细胞中SHH表达和肺间充质细胞增殖及ATX表达，并且分别抑制和促进肺间充质细胞Foxf1的表达。外源SHH重组蛋白提高了MCs的增殖能力和增殖相关基因Stat1、Has2、Hmga2及ATX的表达，降低了Foxf1的表达；外源活性SHH还可促进肺铁蛋白和调节铁代谢相关基因表达。基因过表达和基因沉默实验证实SHH与Foxf1相互正调控；铁抑制Foxf1的调控蛋白Klotho的表达，可能进而调控Foxf1及其下游基因ATX及MCs增殖。SHH通路抑制剂LDE225对MACs和肺MCs中自由铁池（LIP）水平有降低趋势，并减轻了BLM致小鼠肺纤维化程度。本项目证明SHH/Fe/Klotho/FOXF1信号通路调控MCs的增殖在肺纤维化过程中发挥调控作用，并首次发现氯碘羟喹及LDE225可作为治疗肺纤维化的候选药物，SHH和Foxf1可作为治疗肺纤维化的新靶点。本项目的成果为明晰PF的致病机理提供新思路，为抑制或逆转PF提供新型有效的治疗策略和理论依据。