机械通气诱导外泌体miRNA在急性肾损伤自噬中的作用及分子机制

Mechanical ventilation is an important factor associated with acute kidney injury (AKI) in ARDS. The injury of renal tubular epithelial cell is a pivotal pathological feature. Depressed Autophagy in renal tubular epithelial cell aggregate the kidney injury. The mechanism of Ventilation induced AKI was proposed through effects on arterial blood gases, systemic flow and biotrauma. We suppose to extent the inflammation mediator to exosomal miRNA. We speculated that exosomes are the medium between the lung and kidney, the transmembrane proteins of exosomes directly interact with the signaling receptors of the renal tubular epithelial cell, then miRNA regulate the autophagy, promote the AKI. This subject intends through mechanical stretch the airway epithelial cell to demonstrate the presence of exosomes, to study the exosome effect on autophagy by miRNA in renal tubular epithelial cell. In rat ARDS ventilation model, to explore influence of the exosome miRNA on AKI. This research will provide a new approach for clinical targeted therapy.

急性呼吸窘迫综合症(ARDS)患者行机械通气是急性肾损伤(AKI)发生的重要影响因素。肾小管细胞的损伤是AKI发生的关键病理特征。众多报道称肾小管上皮细胞自噬作用被抑制后可加重肾损伤。既往研究局限于动脉血氧、血液循环和生物伤。我们拟将存在较多争议的生物伤概念中的炎症因子扩展到携带有生物调节功能的miRNA的外泌体。我们推测外泌体是肺与肾之间相互作用的介质，机械通气引起肺上皮细胞外泌体miRNA表达变化，外泌体经循环进入肾脏后，通过膜上特异蛋白识别后进入肾小管上皮细胞，同时将其所携带的miRNA带入细胞内发挥作用，调节肾小管上皮细胞的自噬，促进AKI的发生。为此，本研究拟通过体外牵张肺上皮细胞，证实外泌体的产生，研究外泌体对肾小管上皮细胞自噬作用的影响及miRNA调节机制。并在ARDS大鼠通气模型中探讨外泌体携带miRNA对AKI的影响。本研究将为ARDS通气患者AKI的防治提供新的靶点。

机械通气是ARDS患者的有效抢救手段，但不适当的机械通气不仅可以加重肺损伤，而且能引起远端脏器衰竭。在ICU中，最早发生衰竭的脏器常为肾脏。经本研究证实外泌体是肺肾相互作用的介质之一，ARDS外泌体所携带的miRNA进入肾小管上皮细胞，参与调节其自噬和凋亡。我们主要研究内容及结果如下：（1）证明ARDS大鼠血浆外泌体富含miRNA，且与对照组比较，miRNA表达水平发生显著变化。气管灌注盐酸并对大鼠进行6小时损伤性机械通气，成功建立大鼠ARDS的打击模型，确认建模成功。成功提取大鼠血浆外泌体，证明ARDS大鼠模型的血浆中存在外泌体，且用共聚焦显微镜证实NRK-52E能摄取荧光染料标记的外泌体。通过ARDS大鼠血浆外泌体非编码RNA测序分析发现，且与对照组比较，ARDS大鼠血浆外泌体miRNA表达水平发生显著变化。实时荧光定量PCR验证mir-122-5p、mir-192-5p、miR-143-3p与miR-145-5p在ARDS大鼠血浆外泌体中差异表达并具有统计学意义。（2）miR-143-3p与miR-145-5p对RPTEC的作用及机制的研究。在RPTEC中过表达miR-143-3p，检测自噬标志蛋白，发现LC3II/LC3I 比值增大，证明miR-143-3p促进RPTEC细胞自噬的发生。在RPTEC、Beas-2b中高表达miR-145-5p，诱导细胞发生凋亡。miRNA靶位点软件预测并结合蛋白质组学结果，推测RBM3可能是miR-145-5p的靶位点。后经实验证实RBM3是miR-145-5p直接作用的靶位点。（3）miR-145-5p对RPTEC细胞蛋白质组学的影响。在RPTEC中分别高表达miR-145-5p后，收集蛋白进行蛋白质组学分析。结果发现caspase 7、caspase 10、BAK这些参与细胞凋亡的起始和执行的蛋白升高，进一步证实了miR-145-5p诱导人近端肾小管细胞凋亡。通过蛋白质组学信号通路的富集分析推测miR-145-5p可能通过影响JNK通路参与调节细胞凋亡。