环状RNA CDR1as在山羊骨骼肌卫星细胞分化中的作用及分子海绵机制

Uncovering the molecular regulation mechanism of muscle growth is considered as the breakthrough for meat-type goat breeding. Increasing evidence has shown that ncRNAs (noncoding RNAs), like miRNA (microRNA) and lncRNA (long noncoding RNA), play critical roles in regulating muscle cell differentiation. Nevertheless, as far as we known, there is no report on roles of circRNA (circular RNA), another type of ncRNA enriched in muscle, in the process and regulatory mechanism of muscle development. We have found out that circRNA CDR1as is closely related with differentiation of goat skeletal muscle satellite cells (SMSCs). Here, using RNA-seq, Pulldown, FISH and RIP, etc., we intend to screen and verify the critical miRNAs affected by CDR1as in differentiating SMSCs, and further study the main functions and metabolism pathways of these miRNA-targeted mRNAs and lncRNAs. Finally we will unveil the comprehensive ‘miRNAs molecular sponge’ mechanism of CDR1as in SMSCs. The CDR1as-miRNAs-mRNAs/lncRNAs networks constructed here will represent an important level of epigenetic regulation for muscle, and will have important theoretical significance for revealing the whole molecular mechanism of muscle growth and development as well.

肌肉生长的分子调控机制解析是肉羊分子育种改良的突破口。大量研究证实在肌细胞分化中，miRNA和lncRNA等非编码RNA的调控发挥了重要作用，但对于肌肉组织中广泛存在的环状非编码RNA（circRNA）在该过程中的作用及机制仍未见报道。申请人前期研究发现，环状RNA CDR1as与山羊骨骼肌卫星肌细胞（SMSCs）分化密切相关。本项目拟采用RNA-seq、Pulldown、FISH和RIP等技术筛选并验证CDR1as在SMSCs分化中的关键节点miRNAs，研究这些miRNAs的靶标mRNAs和lncRNAs富集的主要功能和代谢通路，全面解析CDR1as在SMSCs分化中的miRNAs分子海绵机制。本研究构建的CDR1as-miRNAs-mRNAs/lncRNAs肌细胞分化调控网络将代表肌肉组织表观遗传调控的又一个重要层次，对全面揭示肌肉生长发育的分子机制具有重要理论意义。

肌肉生长的分子调控网络解析是肉羊遗传育种领域研究核心。基于环状非编码RNA CDR1as前期研究结果，项目申请人主要采用RNA-seq、Pulldown、FISH、RIP等技术系统分析了CDR1as在肌细胞分化中的调控作用及关键节点miRNAs通路。主要结果如下:.1 完成了山羊CDR1as的细胞定位、稳定性分析及其表达模式研究。发现CDR1as增殖和分化期细胞的胞质中分布，且在分化期细胞中表达水平高于增殖期；在E75d到E105d时期，CDR1as呈现极显著的高表达，且在肌肉组织中处于中高表达水平，出生后肌肉组织中CDR1as水平急剧下降。.2 确认了成肌分化因子MyoD对CDR1as的转录调控。MyoD与CDR1as在细胞和组织中的表达水平呈现协同性，过表达和干扰MyoD后，CDR1as水平相应升高和降低，进一步分析发现，CDR1基因启动子区具有MyoD结合位点，MyoD可以极大地促进CDR1as的转录,该结果进一步证明了CDR1as是调控成肌的重要基因。.3 筛选出了肌细胞分化过程中受CDR1as调控的miRNAs及mRNA基因。利用polyA+ RNA-seq共检测到27953个转录本，其中差异表达的共有789个（上调388，下调401），lincRNA基因7个。小RNA测序检测到529个miRNAs，其中129个新的miRNA, 差异表达miRNA共43个（27miRNAs上调，16个miRNAs下调）。.4 初步确定了CDR1as通过作为miRNA的分子海绵调控肌分化涉及的主要通路，包括：CDR1as-miR-7-IGF1R、CDR1as- miR-27a-3p-ANGPT；CDR1as-miR-362-5p-STAT2；CDR1as-miR-19a-MEF2C以及CDR1as-miR-145-3p-MYBL1/COX1/ COX3等。.5 验证了CDR1as-miR-7-IGF1R、CDR1as-miR-27a-3p-ANGPT1和CDR1as-miR-145-3p-MYBL1通路对山羊肌细胞增殖和分化的调控作用。.总之，项目组全面完成了研究计划，所构建的CDR1as调控网络代表了肌肉组织遗传调控的一个重要层次，为全面揭示肌肉生长发育的分子机制奠定了科学的理论基础。