拟南芥核孔蛋白SBB1/NUP85调控受体激酶BAK1介导的自发性细胞死亡分子机理

Nucleoporin is an important carrier for nucleocytoplasmic trafficking, but only partial functions of a few plant nucleoporins have been annotated up to now. In our previous studies, a nucleoporin named SBB1/NUP85, was identified to directly modulate Arabidopsis receptor-like kinases BAK1-mediated spontaneous cell death control via a genetic suppressor screen. Loss-of-function of SBB1 is able to specifically prevent several key proteins importing into the nuclei and moderate endogenous salicylic acid content. Proteomics and genetics evidence have shown that a DEAD box RNA helicase DRH1 locates in a protein complex with SBB1 in regulating spontaneous cell death and mRNA export from the nuclei. However, the molecular mechanisms of cell-death control by SBB1 and DRH1 are still largely unknown. Based on our results in previous studies, our current proposal is aimed to explore the nucleocytoplasmic transportation mechanisms of mRNA and proteins by nucleoporins and to further elucidate the molecular mechanisms of SBB1 and DRH1 controlled nucleocytoplasmic trafficking of proteins and mRNAs in BAK1-mediated spontaneous cell-death control by using genetic, biochemical, molecular biology, cell morphology and omics approaches, which will help us to further understand the novel functions of the plant nucleoporins and signal transduction of plant cell death and provides more theoretical proofs for crops improvement by biotechnologies.

核孔蛋白是细胞核与细胞质之间信息交流的重要载体，但目前仅有少数植物核孔蛋白的部分功能被诠释。申请人在前期研究工作中，用遗传学方法筛选鉴定到核孔蛋白SBB1/NUP85直接调控拟南芥受体激酶BAK1介导的自发性细胞死亡，其功能缺失突变能阻止部分关键蛋白入核并调控内源水杨酸含量。蛋白组学及遗传学研究发现DEAD box类RNA解旋酶DRH1与SBB1在同一复合物共同调控细胞死亡和mRNA出核。然而，它们共同调控细胞死亡的分子机理还不清楚。本项目将在此基础上，运用分子遗传学、生物化学、细胞形态学及组学等方法探索核孔蛋白调控mRNA和蛋白的核质转运机制，进一步深入揭示SBB1和DRH1调控的核质穿梭蛋白和mRNA在BAK1介导的细胞死亡信号转导中的作用，其结果将有助于我们进一步认识植物核孔蛋白新的生物学功能以及植物细胞死亡信号转导途径，并为利用生物技术手段改良农作物使其抗逆高产提供理论依据。

植物类受体激酶是位于细胞质膜上的一类单次跨膜蛋白，往往处于信号转导的上游，主要以磷酸化修饰的方式参与调控植物生长发育与环境适应等各个方面。受体激酶BAK1及其同源蛋白BKK1同时缺失后，植物发生不可逆的光和水杨酸依赖的细胞死亡，但其机制还知之甚少。我们前期使用激活标签法从bak1-3 bkk1-1双突变体中筛选到了核孔蛋白基因SBB1，并从其复合物中鉴定到RNA解旋酶DRH1，它们的缺失突变均能抑制bak1 bkk1的细胞死亡。本项目在此背景下，以拟南芥Col和bak1 bkk1双突变体及相关三突变体为材料，从生理生化及遗传角度研究了SBB1/DRH1参与BAK1介导的细胞死亡机理。结果发现光并不是导致bak1 bkk1细胞死亡的必要直接原因，由黑暗到光照的过程中以及光强的增加可能诱导了更多活性氧的积累，因而进一步加剧了细胞死亡的发生；发现由暗到光的转移以及过氧化氢的处理可不同程度诱导BAK1磷酸化的上调。在此基础上，我们使用磷酸化组学筛选到34个受体激酶的磷酸化在bak1-4 bkk1-1强致死突变体中显著下调甚至消失，发现一个新的RLK过表达能抑制bak1 bkk1的细胞死亡。发现了高温能抑制bak1 bkk1的细胞死亡且PAD4的缺失突变能抑制bak1-3bk1-1中EDS1等基因的表达。通过核质分离及蛋白印迹实验发现SBB1的缺失突变能在一定程度上影响NPR1和PAD4进入细胞核，表明bak1 bkk1双突可能启动了效应子触发的自免疫反应，SBB1的突变能抑制该自免疫过程。筛选和鉴定到至少2个基因的缺失突变能抑制bak1 bkk1的细胞死亡，且它们和另外4个R基因受到DRH1和SBB1的影响。这些研究揭示了细胞质膜上BAK1/BKK1的变化以及核孔复合物SBB1/DRH1在细胞死亡中的重要作用，为进一步深入解析受体激酶介导的自免疫反应信号转导通路提供了新的思路。