LncRNA MEG3调控TGF-β及其信号通路介导肝星状细胞激活在放射性肝损伤中的机制研究

Radiation induced liver disease(RILD) is a bottleneck problem of radiotherapy for hepatic cancer, the research on finding effective molecular targets has a great significance. Our previous studies found that the activation of hepatic satellite cells(HSC) is a pivotal event in process of RILD, TGF-β and its TGF-β/smad and PI3K/Akt signal pathway play important roles. But the upstream regular molecular factors are still unknown. Numberous studies have demonstrated that long non coding RNA are being increasingly recognized as major players in governing fundamental biological processes through diverse mechanisms. In our study, MEG3 levels were remarkably decreased in the human HSC cell line (LX-2) after radiation, （Fold change：12.99）, indicated that lncRNA MEG3 may represent a novel regulator to modulate HSC activation and RILD. Thus, our research intends to explore the RILD relating key factors and signal pathway regulated by MEG3, to focus on “MEG3→TGF-β→smad and/or PI3K/Akt pathway→HSC activation→RILD”, using molecular biology techniques, from cells – animals -tissue three aspects. This research will help to illustrate the molecular mechanism in RILD and to find clinical transformation molecular targets for prevention and treatment for RILD.

放射性肝脏损伤（RILD)是肝癌放射治疗的瓶颈问题，寻找有效的干预分子靶点尤为迫切。本课题组前期研究发现：肝脏星状细胞（HSC)激活是RILD关键事件，其中TGF-β介导的TGF-β/smad及PI3K/Akt信号通路在这一过程中扮演重要角色。但是这一过程上游调控分子尚未知晓。近年来的研究发现，长链非编码RNA在多种生物过程中发挥重要的调控作用。我们前期预实验提示：LncRNA-MEG3在人HSC细胞系LX-2照射后呈现显著低表达（Fold change：12.99），提示MEG3可能是RILD发生过程中重要的调控分子。因此，本项目拟从细胞-动物-组织三个层面，研究MEG3调控RILD发生的关键因子和通路，着重验证“MEG3→TGF-β→smad和/或PI3K/Akt通路→HSC激活→RILD发生”这一科学假说。本研究有助于阐明RILD发生的分子机制，为RILD的防控寻找潜在的分子靶点。

放射治疗是肝癌治疗的有效手段之一。针对目前在临床实践中放射性肝脏损伤分子机制不明继而缺乏有效的防治措施这一现状，本研究旨在初步阐明LncRNA MEG3在放射性肝脏损伤中扮演的分子机制。主要研究内容包括：1.针对肝脏肿瘤相关的三个典型的细胞系：肝星状细胞系LX2、肝脏正常细胞系LO2、肝癌细胞系HepG2 细胞的 MEG3 基因本底表达检测；2.对上述三个细胞系（LX2、LO2、HepG2） 细胞放射处理条件及转染方式摸索；3.为了探究MEG3 与 TGF-β及 PI3K/Akt 通路相关性研究，将LX2和HepG2两种细胞系分别分为：空白组、pIRES2-NC组、pIRES2-MEG3组、10Gy空白组、10Gy-pIRES2-NC组、10Gy-pIRES2-MEG3组共6组细胞，采用CKK8和克隆形成检测细胞增殖；流式细胞仪检细胞的周期和凋亡；qRT-PCR 检测：MEG3、TGF-β、α-SMA、PI3K、Akt基因表达；WB 检测：TGF-β、α-SMA、PI3K、p-PI3K（Ser249）、Akt、p-Akt（Ser473）蛋白表达。研究结果发现：1.在上述三种细胞系中，MEG3 在LX2细胞系中的表达是显著高于其他两种细胞系；2.上述细胞系最佳的照射强度为单次10Gy，最佳的干预时间为48小时，最佳的干预方法是pIRES2-EGFP MEG3质粒转染过表达；3.10Gy照射联合MEG3的过表达会显著抑制细胞的增殖，轻度影响细胞的凋亡，导致细胞分裂阻滞在S期；4.在这一动态变化的过程中，伴随着MEG3对TGF-β和α-SMA的负调控和p-PI3K（Ser249）及p-Akt（Ser473）的动态变化。本项研究的科学意义在于：初步阐明了在放射性肝脏损伤这一动态的变化中，LncRNA MEG3与对TGF-β和α-SMA的负调控和p-PI3K（Ser249）及p-Akt（Ser473）的动态变化，为后续进行放射性肝脏损伤分子药物的研发奠定初步的理论基础。