HTRA1基因突变介导TGF-β信号通路致CARASIL血管平滑肌细胞表型转化和内皮功能障碍的研究

CARASIL is one of an inherited vascular diseases characterized by extensive loss of vascular smooth muscle cells(VSMC) and deposition of collegen and thickening of intima. The related research indicated that HTRA1 gene mutations is probably the pathogenesis through the signaling by the TGF-β/Smads. But it is not clear the changes of structure and function of vascular smooth muscle cells and endothelial cell. Based on the previous data, we would study the expression of HTRA1，TGF-β/Smads，extrocellular matrix and phenotype protein on the vascular wall through immunohistochemistory, Western blot and RT-PCR. We would study the changes of vascular smooth muscle cells and endothelial cell, when transfectioned with mutant HTRA1 gene in vitro, through the HTRA1 protease , TGF-β/Smads , phenotype of VSMC and excreted factors of endothelial cell.To explore the relationship of mutant HTRA1 with TGF-β/Smads、ECM、SMα-actin 、SM22α、OPN、NO、ET and PDGF, it was helpful to explain the mechanism of mutant HTRA1 gene and its signaling passway to vascular dysfunction of CARASIL.

CARASIL是病理上表现为平滑肌细胞丢失伴胶原纤维沉积和内膜增厚的遗传性脑血管病。研究表明HTRA1基因突变并引起TGF-β1/Smad信号通路异常为其可能的发病机理。但对血管平滑肌和内皮的结构功能改变的机制尚不清楚。基于前期对该病研究，本课题拟采用免疫组化、Western blot、RT-PCR等方法观察血管壁上HTRA1、TGF-β/Smads、细胞外基质以及血管平滑肌细胞表型蛋白的表达；并于体外研究HTRA1突变基因转染对血管平滑肌细胞和内皮细胞中HTRA1、TGF-β/Smads的影响，及血管平滑肌细胞结构蛋白表达及内皮细胞主要分泌因子的影响，探讨HTRA1基因突变与TGF-β/Smads、ECM、SMα-actin 、SM22α、OPN、NO、ET、PDGF等的相关性，阐明基因突变致信号通路改变在CARASIL血管损害中的作用机制，为靶向治疗CARASIL提供理论依据。

CARASIL是病理上表现为血管平滑肌细胞（SMC)丢失伴胶原纤维沉积和内膜增厚的遗传性脑血管病。研究表明HTRA1基因突变并引起TGF-β1/Smad信号通路异常为其可能的发病机理。但对SMC和内皮细胞（EC)的功能影响的机制尚不清楚。目前国内外尚无类似研究。研究SMC和EC的结构和功能变化对于进一步探讨CARASIL的发病机制尤为重要。课题组前期报道了HTRA1基因新的突变位点1091C>T(L364P)，本课题将此突变基因转染SMC或病毒包装后感染SMC，培养48h后检测三组细胞的增殖、迁移和凋亡，并提取细胞内蛋白及RNA，采用Western blot、RT-PCR等方法观察SMC中HTRA1、TGF-β/Smads、NOX4等在基因及蛋白水平的表达；荧光探针 DCFH-DA 检测细胞内活性氧水平。同样转染血管内皮细胞后ELISA检测细胞内外内皮素ET-1、血小板源生长因子（PDGF-BB ）、NO及eNOS含量。结果显示：1.成功建立HTRA1 及 HTRA1-Mut 基因慢病毒载体感染血管平滑肌细胞模型；2. L364P突变基因导致SMC内HTRA1mRNA减少（P<0.05）以及HtrA1蛋白表达减少；3. L364P组中的TGF- β1及Smad2/3的mRNA表达增多（P<0.01），同时蛋白含量也增加；4. 与野生型基因转染组相比，L364P突变基因导致SMC增殖缓慢，Transwell 转移率降低(P<0.05)，与空白转染组相比，细胞凋亡数无变化；5. L364P突变基因导致细胞内活性氧产量增加，NOX4 蛋白表达升高；6.基因突变使内皮细胞分泌ET-1增加（P＜0.05），细胞内外PDGF-BB、NO及NOS表达下降（P＜0.05）。以上结果提示了HTRA1基因突变(L364P)后导致HTRA1基因及蛋白水平表达下降，并且SMC内TGF-β/Smad信号通路分子的表达上调。同时在蛋白水平影响 NOX4 有关的氧化还原反应。 而细胞增殖迁移能力的下降可能与细胞内的氧化应激、内皮细胞ET/NO失衡，PDGF-BB的分泌减少有关。最终影响了损伤血管结构的重塑。这些因素很可能是CARASIL临床病理机制之一。