力学刺激诱导下通过重演骨发育过程实现大面积骨缺损修复

现有骨缺损修复方法尚不能完全满足临床需要。尤其是大面积缺损修复的细胞支架复合物植入体内后血供建立缓慢，是一直制约修复效果的难题。本研究拟利用工程化软骨的特性在克服血供问题的同时为骨缺损修复提供新的选择。已有少数实验室初步发现胚胎干细胞来源的工程化软骨有助于骨缺损修复。申请者前期研究观察到骨膜干细胞来源软骨实现了对关节软骨下骨的骨缺损修复，证明了低频超声和脉冲电磁场可以增强生长因子的成软骨分化诱导能力。.本研究拟通过①体外实验，探讨低频超声和脉冲电磁场替代或增强传统成软骨诱导方式的方法；筛选出诱导软骨分化的最适支架材料和可控力学刺激方式；②体内实验进一步筛选出诱导体内软骨内钙化的力学刺激条件；③根据前期结果，在力学刺激参与下，使用工程化软骨修复骨缺损的动物模型验证软骨修复骨缺损的方法。以期实现通过重演胚胎时期骨发育来有效修复骨缺损，同时利用软骨的生理特点解决骨缺损修复初期面临的血供问题。

骨组织缺损的修复问题一直是临床关注的重点，但现有修复方法尚不能完全满足临床需要。尤其是大面积缺损修复的细胞支架复合物植入体内后血供建立缓慢，是一直制约修复效果的难题。有学者提出，最佳的组织重建应该是在成熟个体内对胚胎时期发育过程的重演，并提出了发育组织工程学(Developmental Engineering)这一概念。目前，有部分学者尝试以组织工程化软骨为中介，避开血供制约，通过“重演”软骨内成骨的过程，修复大面积骨缺损。本研究利用工程化软骨的特性在克服血供问题的同时，采用超声(US)和脉冲电磁场(PEMF)两种非侵入性物理刺激影响成软骨和成骨的过程，为骨缺损修复提供新的选择。.本研究通过①体外实验，探讨了不同强度的US和PEMF刺激对大鼠骨髓干细胞增殖、体外成软骨分化，以及对成软骨分化后肥大化的影响。筛选出了诱导软骨分化及软骨内成骨的最适可控力学刺激方式。研究发现，所选参数的LIPUS(强度为100-，150-，200mW/cm2；占空比20%；工作频率1MHz；重复频率1kHz)及PEMF(强度为1-，2-，5mT；刺激时间3h/d；工作频率750Hz；脉冲频率75Hz)刺激对大鼠骨髓干细胞早期增殖没有显著影响。在成软骨诱导培养基持续存在的情况下，LIPUS刺激上调II型胶原和aggrecan的表达，抑制X型胶原、I型胶原及BSP的表达，抑制肥大化进程，维持软骨表型。其中150mW/cm2具有更显著的生物学效应。然而，在成软骨培养基持续存在的情况下，PEMF刺激能下调II型胶原和Sox9的表达，抑制干细胞微球的成软骨方向分化，抑制软骨基质合成。其中1mT的PEMF刺激还能上调I型胶原、X型胶原、BSP和Osx的表达，直接诱导干细胞微球向肥大化和成骨方向分化。②体内实验，在裸鼠皮下植入细胞支架复合物，进一步筛选出诱导体内软骨内钙化的力学刺激条件。3.在没有施加物理刺激的情况下，未在体外分化培养的细胞支架复合体植入体内后，复合体逐渐被吸收分解；在US和PEMF作用下，US和PEMF能够促进干细胞支架复合体内纤维束的形成，尤其是US还可以促进新生血管和细胞外基质的形成的形成。体外成软骨诱导后的细胞支架复合体植入裸鼠皮下后吸收分化的速度更快；在US和PEMF作用下（尤其是US作用下），有大量的基质以及网状胶原纤维形。.本研究证明了适当的物理刺激能够促进干细胞微球及干细