基于新发现的家族性偏瘫型偏头痛致病基因突变位点建立相关疾病模型

Migraine is a high prevalent, disabling and undertreated episodic brain disorder, of which the mechanism remains unclear. Familial hemiplegic migraine (FHM) is a monogenic migraine syndrome with autosomal dominant inheritance, which is a potent tool for migraine research. We found a FHM family with two novel missense mutations. In order to clarify the function of these two novel mutations and explore the roles of different neuronal cells and ion channels involving in the migraine, and culture special cellular or animal models of migraine, we are going to do the systematic researches from bedside to the bench. First, transient transfect the different cell lines with the mutation vectors to observe the changes of cellular viability and electrophysiology. Second, predict the variation of the coded protein structures by the structural bioinformatics software. Third, generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from familial members and normal controls and differentiate iPSCs into neural cells, to set a kind of patient specific cellular disease model. Then, develop two strains of transgenic mice with two novel variants, using the Cre/loxP techniques. Based on these two strains of transgenic mice, give stimuli on the dura matter of the superior sagittal sinus, and detect the pathophysiological changes both in vitro and in vivo. And then, inject viral vectors with one mutant gene stereotaxicly into the brain of a strain of transgenic mice which carry the other mutant gene.These findings might open up new avenues for improved migraine prophylactic treatments and might also further the understanding of the pathology of migraine and migraine-comorbid disorders.

家族性偏瘫型偏头痛（FHM）是常染色体显性遗传病，是研究偏头痛理想的疾病模型。本课题组已发现一个家系携带两个新的FHM基因突变位点ATP1A2（R279Q）、SCN1A（F1763V）。为明确二者及其编码离子通道结构功能的变化，探索不同类型神经细胞参与偏头痛的发生机制，建立并培育自主细胞及动物疾病模型，拟进行如下试验：将每个突变位点单独导入工具细胞或条件性敲入Cre小鼠中评价其生理功能变化和致病性；利用诱导多潜能干细胞技术培养患者来源的特异性细胞模型，并培育某一新突变的全身型基因敲入小鼠，再将另一新突变定向导入该小鼠脑中，以观察两个基因突变和其所在的神经细胞相互作用的致痛机制。通过上述方法建立更符合偏头痛特征的细胞和动物模型，深入探索偏头痛发病机制，为研发新的疾病干预措施提供有力工具。

在临床工作中，我们发现了一个特殊的家族性偏瘫型偏头痛（FHM）伴癫痫家系，家系患者携带两个新的FHM基因突变位点ATP1A2（R279Q）和SCN1A（F1763V）。为了探究这两个新发突变基因是否都致病以及致病程度，进而探讨二者对相应编码蛋白功能的影响，我们申请了本项目。此外，在本课题的支持下，我们发现并报道了一个新的单纯FHM家系携带ATP1A2（G762S）突变，通过对这一突变的功能研究加深了我们对ATP1A2突变功能改变的认识。因此后续研究中，为了探究同一基因不同突变位点对临床表型的影响，我们选择了包括R279Q和G762S在内的，ATP1A2的10个不同突变位点进行结构-功能-表型研究。Western blot检测发现，尽管突变型质膜蛋白略有减少，但与野生型（WT）相比无统计学意义（P >0.05），这表明ATP1A2突变不会影响其编码蛋白在细胞膜上的表达量。细胞存活试验显示：与WT相比，在转染60小时后，突变体细胞存活率显著降低，表明突变确实抑制了钠泵基本功能（P＜0.01）。细胞酶活性检测发现，WT转染细胞的酶活性均高于突变体。在含有10μM哇巴因的培养基中，引起FHMEI （FHM伴癫痫和智力障碍）的突变的总体酶活性明显低于引起FHM（P <0.0001）和FHME（FHM伴癫痫）的突变（P <0.001）的酶活性，表明与临床表型谱的多少密切相关。在100μM哇巴因存在下，酶活性水平为：WT> FHM> FHME> FHMEI。我们继续分析了哇巴因敏感性的酶活性。与上述发现一致，在存在10μM哇巴因的情况下，WT的哇巴因敏感性酶活性明显高于突变组。我们针对感兴趣的三个突变点进行了电生理实验，结果提示伴有智力障碍的FHM突变G615R表现出更异常的漏电流和钠离子亲和力改变。同源建模及蛋白质结构分析表明，G615残基可能参与构成蛋白质隧道，这有助于我们更好的解释疾病的临床表型和编码蛋白功能损害之间的关系，有助于深入理解FHM不同临床表型谱的成因，进而有助于不同药物作用位点的机制研究。本课题部分成果已经发表SCI论文24篇，中文期刊2篇，SCI在投2篇。