靶向磁性仿酶双功能吸附剂的可控制备及其分离降血压肽机制研究

In recent years, affinity adsorption technique was already successfully applied in separation of angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides (antihypertensive peptides), such as immobilized enzyme and Immobilized metal ion affinity technology. However, those separation methods may be high cost and in the absence of targeted screening. Studies showed that most of ACE-inhibitory peptides can combine with metal ion and has membrane affinity properties. Metal affinity-immobilized liposome chromatography (MA-ILC) was a new affinity chromatography that was similar with the combination between antihypertensive peptides and ACE. In order to improve the selectivity of separation and the simplicity of operation, this project will combine MA-ILC and magnetic separation for purification of antihypertensive peptides. A magnetic mimic enzyme bifunctional adsorbent (MT/MA-IL) was prepared by encapsulating nano Fe3O4 with phospholipid membrane and then was modified with metal ions. MT/MA-IL will be evaluable for the recovery of antihypertensive peptides from complex systems and the effects of metal ions on purification efficiency for antihypertensive peptides was investigated. The thermodynamics of absorbent MT/MA-IL binding to peptides and its kinetics will be quantified with isothermal titration calorimetry (ITC) and spectrum method, so the combination mechanism of metal ion ligands with antihypertensive peptides will be discussed. The binding force between ligands and antihypertensive peptides will be quantified and controlled. The results would also provide a theoretical foundation and technical support for the efficient separation and purification of antihypertensive peptides.

近年来固定化酶及固定化金属离子等亲和分离技术已成功应用于血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽（降血压肽）的分离，但存在成本过高或特异性不足等问题。研究表明大部分降血压肽具有一定金属离子亲和及膜亲和特性。新型色谱固定化金属离子-脂质体亲和色谱（MA-ILC）的吸附特性与降血压肽对靶酶的结合作用类似。为了提高分离靶向性及操作的简便性，本项目拟将MA-ILC与磁力分离结合，以磷脂膜包裹纳米Fe3O4,形成仿细胞膜结构的磁性脂质体；并以金属离子修饰其表面，使之具有金属离子及膜亲和的双吸附功能。通过探索金属离子配基种类等因素对降血压肽富集效果的影响，可控制备特异性高的磁性仿酶双功能吸附剂（MT/MA-ILC）。采用等温滴定量热和光谱技术对其与降血压肽的结合过程动力学和热力学特征进行研究，从分子水平揭示其分离机理，为开发新型高效的降血压肽分离技术提供理论基础和技术支持。

近年来，固定化酶及金属离子等亲和吸附技术已成功应用于血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽（降血压肽）的分离。但存在成本过高或特异性不足等问题。为了提高分离靶向性及操作的简便性，本项目将新型色谱固定化金属离子-脂质体亲和色谱与磁力分离结合，构建了具有双重吸附作用磁性仿酶双功能吸附剂。本项目按项目计划书执行，主要完成了以下研究工作： . 合成了金属离子螯合剂N-十六烷基亚氨基二乙酸（HIDA）。以磷脂、HIDA、纳米四氧化三铁为材料，制备磁性脂质体，并其进行表征。磁性脂质体形态良好，透射电镜显示四氧化三铁成功包裹于脂质体中，平均粒径在600nm左右，磷脂含量为143.25ug/mg。以磁性脂质体为载体，分别螯合金属离子铜、锌、镍离子，其中镍离子32µmol/g，铜离子31µmol/g，锌离子27µmol/g，成功制备了磁性仿酶双功能吸附剂（MA-IML）系列。通过吸附实验表明MA-IML-固定化镍离子（MA-IML-Ni2+）吸附效果较好。项目深入研究了MA-IML-Ni2+吸附降血肽YP、VY、VPP、IPP、RYRP动力学及热力学，获得了相关参数。以粒内扩散模型、准一级动力学模型、准二级动力学对进行拟合，其中准二级动力学模型的拟合效果较好（R2>0.9），可以较好地描述吸附过程。MA-IML-Ni2+对此四个降血肽吸附的焓变△H、吉布斯自由能△G和熵变△S均为负值，表明吸附过程是一个放热、熵减、自发反应的过程。. 此外，除了完成项目计划书中的研究内容，在已取得的研究成果基础上，课题组开展了延伸研究。探索利用MA-IML-Ni2+从复杂的长蛇鲻蛋白酶解物中富集降血压活性组分，HPLC进一步分离，两步法获得降血压肽YR、VYP、RAPV，其IC50值分别为227μM、108μM、266μM，具有较好降血压活性，大幅提高了分离效率。本课题将为降血压肽分离提供理论基础、技术支持和新的筛选模式。