应用基因随机致变提高鸡柔嫩艾美尔球虫EtMIC2蛋白质保护性免疫原性的研究

筛选鉴定保护性抗原是研制鸡球虫基因/重组/亚单位疫苗的关键基础。目前尚无好的方法从鸡球虫自然表达的蛋白质中有效的筛选鉴定出保护性抗原。本研究拟采用基因随机致变技术, 对编码鸡柔嫩艾美尔球虫EtMIC2蛋白质的基因进行人工诱导变异进化，旨在提高EtMIC2的保护性免疫原性。将致变的EtMIC2基因在酵母菌细胞内表达并展示在其表面，构建变异的EtMIC2蛋白质文库。然后用具有一定保护力的抗EtMIC2蛋白质多/单克隆抗体连续筛选，结合本动物实验，筛选出保护性免疫原性大幅度提高的变异EtMIC2蛋白质。相比从鸡球虫自然表达的蛋白质中筛选鉴定保护性抗原，本研究有下列优点: (1)简单快速可靠，(2)抗原性强，(3)可突破鸡球虫逃避宿主免疫攻击的机制，(4)酵母菌表面展示的球虫抗原结构接近其自然状态，使抗体筛选更加有效可靠。(5)为相关后续研究提供丰富资源，(6)迭代性, 不会造成研究资源的浪费。

项目背景：目前尚无简单可行的方法筛选鉴定出鸡球虫自然表达的保护性抗原。本研究采用基因随机致变结合酵母菌表面展示及FACS筛选技术，对编码鸡柔嫩艾美尔球虫微线蛋白质EtMIC2的基因进行人工诱导变异进化，以获得高保护性免疫原性的变异EtMIC2。.研究内容：EtMIC2等基因的克隆、表达及免疫原性鉴定；抗EtMIC2蛋白质单/多克隆抗体的制备与鉴定; 随机致变EtMIC2基因并建立变异EtMIC2基因库;酵母菌表面展示EtMIC2变异蛋白并构建变异EtMIC2蛋白质库; FACS筛选变异EtMIC2蛋白质并结合动物实验评价其免疫原性。.重要结果、关键数据及其科学意义：1、完成了鸡柔嫩艾美尔球虫SD-1株EtMIC1和EtMIC2基因的克隆、鉴定和测序，通过原核和真核表达系统表达蛋白并评价其免疫原性，为本课题选择的EtMIC2蛋白成为随机致变候选抗原提供理论依据。2、成功制备微线蛋白EtMIC1和EtMIC2的单克隆抗体和多克隆抗体。用于变异EtMIC2蛋白质库的优化；应用于检测EtMIC1和EtMIC2的动态表达变化，首次发现，EtMIC1和EtMIC2能够在生活史的配子生殖阶段表达,表明EtMIC2这种重要的微线蛋白可能在有性生殖阶段发挥作用，为选择EtMIC2为变异候选抗原提供理论依据，同时为研究微线蛋白的重要功能提供了技术支持。3、成功构建了两种新型酵母菌表面展示系统。建立了酿酒酵母菌表面展示的EtMIC2蛋白变异库，使筛选简单易行；首次将表面展示技术用于布拉氏酵母菌中，拓宽了布拉氏酵母菌的应用领域；以酵母菌表面展示系统为平台，构建了新型将益生菌作为球虫疫苗载体的输送系统。4、基因随机致变获得2株免疫原性及免疫保护力大幅提高的变异EtMIC2蛋白质。对EtMIC2基因进行人工诱导变异进化，构建了大小为10^7的变异EtMIC2基因文库；及10^8酵母菌表面展示的的EtMIC2变异蛋白质文库。用EtMIC2多克隆抗体连续筛选，结合动物实验，最终筛选出2株变异EtMIC2蛋白质，与未变异的蛋白质相比免疫原性及免疫保护力得到较大的提高。首次通过基因随机致变技术提高鸡球虫抗原的免疫原性，表明基因致变是提高和改善球虫蛋白质免疫原性简单有效的方法，为鸡球虫新型疫苗的研发开辟了新的途径；构建的变异EtMIC2基因/蛋白质库，还可为以后的多项相关基础研究提供资源。