3′-epi-12β-hydroxyfroside诱导自噬下调转运蛋白ABCG2表达逆转肺癌细胞耐药机制研究

Tumor drug resistance is a major problem in cancer chemotherapy. ABCG2 is a subtype of ATP-binding-cassette (ABC) transporters. it participates in the tolerance of tumor to drug treatment through efflux drugs. Previous studies showed that 3'-epi-12β-hydroxyfroside (HyFs) inhibited the activity of ABCG2 in lung cancer cells by down-regulating the expression of ABCG2. Further studies showed that HyFs could induce autophagy in lung cancer cells. After inhibition of autophagy, ABCG2 expression was restored, suggesting that HyFs controlls ABCG2 expression through the induction of autophagy. This project is to further confirm the inhibitory effect of HyFs on the activity of ABCG2 by using inhibitors and RNA interference technology，and to further verify the role of HyFs in inhibiting ABCG2 activity and reversing tumor drug resistance; to clarify the correlation between the ABCG2 activity and the ABCG2 expression through detecting the expression of ABCG2 by real-time PCR and Western blotting; to confirm HyFs-induced autophagy in lung cancer cells by Western blotting, immunofluorescence and electron microscopy; to clarify the regulatory role of autophagy on ABCG2 expression and activity by pharmacokinetics and genetic methods；to screen and confirm the specific gens of HyFs in regulation of ABCG2 expression by analysis of transcriptome and other methods, and finally clarifying the molecular mechanism of HyFs regulating ABCG2 by autophagy. This project elucidates the mechanism of HyFs inhibiting ABCG2 activity and reversing tumor drug resistance, providing a foundation for HyFs as an anti-cancer drug.

耐药使肿瘤难治，转运蛋白ABCG2通过外排药物导致耐药。前期研究发现：3′-epi-12β-hydroxyfroside（HyFS）能诱导肿瘤细胞产生自噬并下调ABCG2表达和活性，抑制自噬后ABCG2表达水平恢复，因此推测HyFs通过诱导自噬来调控ABCG2的表达。本项目在此基础上，采用药物阻断和RNA干扰技术，进一步明确HyFS对ABCG2活性的抑制作用；通过体内外实验验证HyFS抑制ABCG2活性逆转肿瘤耐药的作用；应用实时PCR和免疫印迹检测ABCG2的表达水平，明确ABCG2活性抑制与ABCG2下调的相关性；应用免疫印迹，免疫荧光和电镜等方法明确HyFS诱导肺癌细胞自噬；应用药物和基因方法抑制自噬，明确自噬对ABCG2表达和活性的调控作用；采用分析转录组等方法筛选明确HyFs调控ABCG2的相关蛋白，争取最终阐明HyFS通过自噬调控ABCG2的分子机制，为HyFS应用奠定基础。

目的：3′-epi-12β- hydroxyfroside（羟基糖苷，HyFS）是本团队从海南天然植物牛角瓜中分离提取的一种天然强心苷化合物，我们团队前期研究发现HyFS具有较强的抗癌作用，并通过抑制Hsp90/Akt/mTOR信号通路诱导肿瘤细胞产生保护性自噬，但是自噬降解的靶分子仍未清楚。国外团队研究结果表明，某些强心苷化合物诱导的自噬可以抑制肿瘤细胞的多药耐药，但机制也还没有确认。因此，本研究旨在探讨HyFS诱导产生的自噬是否与肿瘤多药耐药相关，HyFS诱导抑制肿瘤耐药是否通过自噬降解下调多药耐药机器“泵”分子ABCG2表达有关。方法：利用米托蒽醌（MX）耐药的两种细胞株进行体内外实验，采用免疫印迹和共聚焦显微镜检测观察ABCG2和自噬分子表达；用流式细胞术检测ABCG2及其底物水平和细胞凋亡；用MTT检测细胞活性。通过药物抑制和siRNA干扰研究自噬在HyFS介导抑制ABCG2表达的作用。在培养的肿瘤细胞和小鼠肿瘤模型中观察了解HyFS和MX单独或联合治疗诱导细胞死亡和治疗肿瘤的效果。结果：HyFS以剂量和时间依赖性的方式下调ABCG2的表达，并诱导H460/MX20和A549/MX10细胞发生自噬。H460/MX20和A549/MX10细胞自噬抑制恢复ABCG2表达，说明自噬参与了HyFS抑制ABCG2表达的过程。此外，我们还发现，HyFS治疗的肺癌耐药细胞中聚有大量的ABCG2转运底物，说明HyFS治疗抑制了ABCG2介导的底物向胞外转运。进一步的实验发现，HyFS联合MX治疗可明显促使MX耐药H460/MX20和A549/MX10细胞死亡，同时明显增强抑制H460/MX20和A549/MX10细胞的生长和增殖；但是，利用自噬抑制剂或RNA干扰阻断自噬自噬后这些现象消失。此外，我们的体内研究还发现，HyFS治疗可以下调ABCG2表达，HyFS联合MX治疗可明显增强MX的抗肿瘤活性和能力，更好地抑制体内肿瘤的生长。结论：本项目的研究结果表明，HyFS通过自噬降解下调多药耐药“泵”分子ABCG2的表达，从而导致药物在细胞内有效积聚，进而达到增敏抗肿瘤和逆转药物耐药的作用；HyFS和MX联合用药治疗一种潜在的ABCG2表达相关耐药肿瘤的治疗策略，具有一定的转化应用前景。