玻璃酸两性离子化的免疫效应及其机制研究

The structural modification of endogenerous biomacromolecules including deacetylation is an important means of regulating their function. Hyaluronan,one glycosaminoglycan,is an important regulator in inflammation and immunity in vivo. The deacetylation of hyaluronan will generate the zwitterionic derivatives. However,the immunological effects and the underlying mechanisms of this physiological process remains unexplored. Previous evidence shows that different from hyaluronan,zwitterionic derivative of hyaluronan possesses a helix structure similar to that of exogenerous zwitterionic polysaccharide. This result implies that the latter two polysaccharides probably share similar mechanisms in inducing natural and adaptive immune responses. In this proposal, zwittionic derivatives of hyaluronan varied in molecular size and N-deacetylation degree will be prepared. The immune response in vitro and in vivo to these derivatives,such as the activation of antigen presenting cells as well as the proliferation and differentiation of na?ve T cells, is investigated.The role of signalings through Toll-like receptors, Major histocompatibility complexⅡ(MHC Ⅱ)antigen presentation pathway and T-cell receptor crossing will be examined. Finally,the structure-activity relationship will be discussed.This proposal provides an insight to uncover the immunological effects of zwitterionic derivation of haluronan in vivo.Also this proposal will enlarge our understanding biology of zwitterionic plosaccharide, and will give us an oportunity to find novel zwitterionic polysaccharides which can induce regulatory T cells.

去乙酰化等结构修饰是生命体调控内源性生物大分子功能的重要手段。糖胺聚糖类大分子玻璃酸是体内重要的炎症和免疫调节因子，在N-去乙酰化酶作用下会生成玻璃酸两性离子衍生物。然而，这一生理过程的免疫效应及其机制有待研究。申请人前期研究显示，与玻璃酸不同，玻璃酸两性离子衍生物与外源性两性离子多糖具有类似的螺旋结构，暗示后两者可能以相似的信号机制诱导天然和获得性免疫。本申请拟进一步制备出不同分子量和去乙酰化度的内源性玻璃酸两性离子衍生物，从细胞和动物水平来剖析这些衍生物对抗原呈递细胞活化和初始T细胞增殖与分化的影响，考察Toll样受体、MHCⅡ类分子抗原呈递、T细胞受体交联等信号途径在上述免疫响应中的介导作用，并在分子水平上阐明构效关系。本申请对揭示玻璃酸体内两性离子化修饰所产生的免疫效应具有重要的意义，同时拓宽了两性离子多糖生物学的研究范畴，也有助于发现具有诱导调节性T细胞功能的新两性离子多糖分子。

随着年龄老化，糖胺聚糖如玻璃酸（透明质酸）、硫酸软骨素会在N-去乙酰化酶作用下会生成两性离子化的衍生物，但是这一生理过程的所产生的生物学效应及其机制还不清楚。本项目通过肼解法制备了三种不同分子量的高度去乙酰化的透明质酸；采用荧光实时定量PCR测定TNF-α，IL-6 mRNA的表达以及ELISA测定TNF-α，IL-6的分泌量，结果表明去乙酰化透明质酸对抗原呈递细胞的激活能力明显低于透明质酸；通过NF-κB激活－核转运试剂盒和抑制剂实验，发现透明质酸与去乙酰化透明质酸都是通过激活抗原呈递细胞中的核转录因子NF-κB来诱导TNF-α，IL-6的分泌；分别采用 TLR4-/-，TLR2-/-，MyD88-/-缺陷小鼠的骨髓分化的巨噬细胞确定了透明质酸与去乙酰化透明质酸都是通过TLR/MyD88途径来激活抗原呈递细胞，然而，透明质酸主要依赖于TLR4/MyD88途径，相反，去乙酰化两性离子透明质酸更多的依赖于TLR2/MyD88途径；进一步研究表明，透明质酸促进脾细胞增殖主要依赖于TLR4途径，而两性离子化透明质酸更多的依赖于TLR2途径，并且后者对CD4+ T和CD19+ B细胞增殖作用明显强于相应的透明质酸。上述研究表明，透明质酸两性离子化衍生物与细菌荚膜来源的两性离子化多糖能通过类似的信号机制来激活免疫细胞。本项目也考察了去乙酰化修饰对硫酸软骨素免疫活性的影响，结果表明，去乙酰化的硫酸软骨素通过TLR4-MyD88-NF-κB来激活抗原呈递细胞，促进小鼠脾淋巴细胞增殖，诱导卵清蛋白致敏的脾细胞释放细胞因子。本项目对揭示内源性糖胺聚糖去乙酰化修饰所产生的免疫效应具有重要的意义，同时也拓宽了两性离子多糖的研究范畴，有助于发现新的具有免疫活性的两性离子多糖。在本项目的资助下，在糖生物学和糖化学等国际主流期刊上发表SCI论文7篇（基金标注，均为通讯作者），申请国内专利一项，培养博士生1名，硕士生3名。