含羞草beta-根瘤菌共生固氮基因分子进化及菌植互作分子基础的初步研究

The term of beta-rhizobia was proposed as those rhizobium belonging to the beta-proteobacteria. At present, we had accumulated plenty of resources of beta-rhizobial strains through previous study. In order to further study these rhizobia, we intend to characterize molecular evolution of symbiotic nitrogen fixation genes of beta-rhizobia and molecular basis of plant-rhizobia interaction. The project will carry out whole genome sequencing of beta-rhizobia and symbiotic gene clusters will be cloned and sequenced to analyze phylogeny of main symbiotic nitrogen fixation gene based on full-length sequences of gene. While elucidating heredity and variation of symbiotic nitrogen fixation genes, and carry on analysis to the relate gene for ecoadaptability of beta-rhizobia through whole genome. The study will also perform to characterize flavones of Mimosa plant and nodulation factor, and study on differential proteomic of plant-rhizobial interaction for revealing the molecular basis of plant-rhizobia and the mechanisms of competitive nodulation for beta-rhizobia. The results will enrich the research data of the beta-rhizobia China in genomics and genetics, fill the blank of domestic and international, promote to study plant and beta-rhizobia interaction and basic application research in industry and agriculture or environment remediation.

隶属于beta-变形杆菌纲（proteobacteria）的根瘤菌，简称为beta-根瘤菌。申请者通过前期研究积累了丰富的beta-根瘤菌菌株资源，为深入研究beta-根瘤菌，本项目提出对beta-根瘤菌共生固氮基因分子进化及菌植互作分子基础进行初步研究。项目将通过beta-根瘤菌的全基因组测序和共生固氮基因簇的克隆测序，进行基于主要结瘤基因和主要固氮基因全长的系统发育分析，并对共生固氮基因分子的遗传和变异进行研究，对菌株全基因组中与生态适应相关的基因进行分析。同时通过对含羞草植物类黄酮物质和beta-根瘤菌结瘤因子的研究、菌植互作的差异蛋白组学研究，揭示beta-根瘤菌的分子基础及竞争结瘤机制。研究结果将丰富我国beta-根瘤菌在基因组和遗传学方面的研究资料，填补国内和国际空白，并推动beta-根瘤菌菌植互作的植物应答研究和beta-根瘤菌在工农业和环境治理方面的应用基础研究。

以第三代测序— PacBio RSⅡ为平台完成了瘤状伯克霍尔德菌（Burkholderia phymatum HBU08166）、含羞草伯克霍尔德菌（Burkholderia mimosarum HBU53024）、加勒比海根瘤菌（Burkholderia caribensis HBU852011）、台湾贪铜菌（Cupriavidus. Taiwanensis SWF66294）以及归属于alfa-根瘤菌的根瘤菌属（Rhizobium）的菌株HBU08231等5株菌的基因组完成图测序，获得了相关生物信息学数据，由于与已有参比菌株基因组特征差异较大，因此后续尚需验证。选择了这5个种群内的3-4株参比菌株共16株分别进行了共生基因簇的克隆测序，发现种群内的微进化是存在的，其中B. mimosaum种群中，有一段连续相邻的1342bp的核苷酸序列的差异，在此基础上，构建了5个种群的共生基因排列组织结构。通过对含羞草的类黄酮物质的提取、分离和纯化，获得了6种类黄酮成分，分别是麦黄酮(Tricin, C17H1407), 毛地黄黄酮(又名木犀草素，Luteolin，C15H1006），槲皮素（Quercetin，C15H1007），扁蓄苷(avicularin，C20H18011），以及香豆素(Coumarin，C9H6O2)和毛蕊异黄酮(Calycosin，C22H22O10）。研究成功构建了5个种群的分别含有质粒pBBR2-D3 或pBBR2-CBD的两类超表达结瘤因子的菌株，结瘤因子的测定发现了一种新的化合物，经检测与8-甲基对香豆酰基爪钩草苷（8-O-methyl harpagide）相似度为75%。经过对根瘤菌在类黄酮诱导下的蛋白表达差异研究，发现5个种群根瘤菌在类黄酮标品和类黄酮粗品诱导下的蛋白表达具有差异，说明可能不同根瘤菌类群响应不同的类黄酮种类。本研究属于开创性研究，已经建立了菌植互作的分子技术平台，对后期研究奠定了基础，并为根瘤菌与宿主共生选择提供了研究方向。