青兰属药用植物中Nrf2诱导活性成分及其与气道高反应疾病的相关性研究

Nrf2是一种维持细胞正常氧化还原状态的转录因子，在细胞应对氧化应激时，上调包含ARE的编码内源性抗氧剂和Ⅱ相解毒酶的基因转录，提高细胞的防御能力。气道高反应性（AHR）疾病是由于外界刺激所致气道炎症产生ROS，ROS不能被及时清除，堆积引起气道上皮细胞损伤，进而诱发AHR，与氧化还原失衡密切相关。青兰属多种植物民间用作慢性气管炎治疗，我们研究发现该属植物含有的黄酮类和生物碱类成分具有Nrf2诱导作用，可能是AHR治疗的物质基础。将上述三方面内容结合，提出本课题的研究思路：以高通量荧光素酶法作为Nrf2诱导剂的筛选手段，进行活性跟踪的Nrf2诱导剂分离，重点关注青兰属植物中结构新颖的生物碱类成分。对确定的Nrf2诱导剂进行气道上皮细胞保护作用研究，检测对于细胞防御系统的影响，进一步进行初步药效学研究，目的是探讨Nrf2诱导剂在AHR疾病治疗中的作用，为AHR疾病治疗提供新的策略。

Nrf2作为调节细胞氧化还原平衡的主要转录因子，正逐渐成为多种慢性疾病防治的靶标，寻找天然Nrf2诱导剂用以慢性疾病治疗成为一种策略。青兰属植物富含黄酮类成分，多种该属植物作为藏药或维药用于慢性疾病的治疗。本课题在前期发现青兰属植物所含黄酮类成分具有Nrf2诱导作用基础上，开展了多种青兰属植物的Nrf2诱导活性成分研究，并进行了与细胞氧化损伤相关的活性评价研究，为阐明青兰属植物药用物质基础提供了依据。从甘青青兰、异叶青兰、全叶青兰、香青兰中共分离得到化合物100余个，其中从甘青青兰得到4个新spermidine生物碱，从异叶青兰得到4个新黄酮生物碱，1个咪唑生物碱，这是课题组继从岩青兰分离得到生物碱类化合物之后，再次从该属植物分离得到生物碱，验证了课题申报时提出的假说，生物碱成分可能在青兰属植物中普遍存在。利用手性HPLC-CD技术解决了异叶青兰中分离得到的两对黄酮生物碱的对映异构体分离及构型确定，再次证明了该技术在解决化合物立体构型方面的作用。同时，超过50个黄酮类化合物被分离得到，其中从甘青青兰得到2个新黄酮类成分，从香青兰得到1个新黄酮苷类成分。采用稳定转染Luciferase的细胞株MDA-MB-231-Lu对所得化合物进行了Nrf2诱导活性筛选，选择了活性较好同时得量较多的几种黄酮类化合物进行了后续研究。北美圣草素-7-O-葡萄糖苷、北美圣草素和木犀草素均被证明可以剂量依赖性诱导Nrf2蛋白表达增高，且Nrf2下游基因NQO1、HO-1等表达也增高。北美圣草素-7-O-葡萄糖苷诱导Nrf2表达与延长其在细胞内降解时间有关，RT-CES测定结果显示北美圣草素-7-O-葡萄糖苷对H2O2、砷盐、顺铂引发的细胞氧化损伤均具有保护作用。北美圣草素对H2O2引起的PC12细胞损伤具有保护作用，且化合物处理细胞引起胞核内Nrf2蛋白表达增多，同时胞浆Nrf2表达减少，SiRNA转染细胞后化合物保护作用减弱，提示北美圣草素诱导Nrf2具有一定特异性。木犀草素-7-O-葡萄糖苷对阿霉素引发的H9c2细胞氧化损伤具有保护作用。上述研究结果初步表明，青兰属多种植物所含有的黄酮类化合物可以对细胞氧化损伤提供保护，这种保护作用与Nrf2信号途径密切相关。