一种基于时间分辨荧光光谱和荧光相关光谱整合技术的均相荧光免疫检验新方法

In vitro diagnosis based on fluorescence correlation spectroscopy (FCS) have the advantage of ultrasensitivity (single-molecule), fast speed (seconds to minutes) and multifunctionality (simultaneously analyzing molecular concentration, size and interaction). Clinical applications of FCS still need to significantly improve signal photons detected within an unit experimental time, and to dramatically reduce background interferences within the FCS detection volume; the former can be accomplished via applications of plasmonic nanophotonic (PNP) devices to FCS experiments, and the latter can be achieved through statistical filtering (SF) data processing tools based on integrated time-resolved fluorescence spectroscopy (TRFS) and FCS technologies. Thus, this research project will first carry out principal validation experiments applying fluorescence auto-correlation and cross-correlation techniques to high-sensitivity (1-10pM) detections of heart failure biomarker NT-proBNP and myocardial infraction biomarker cTnI respectively, as well as verifying the fluorescence enhancement effects of PNP devices used in such FCS experiments. Next, we will validate the effectiveness of the SF tools in reducing the intrinsic background signals of a blood serum sample. Finally, the research team will develop a point-of-care testing (POCT) instrument, and demonstrate its use for homogeneous, high-sensitivity detection of cardiac biomarkers in a blood serum sample.

荧光相关光谱（FCS）技术具超灵敏（单分子）、快速（数秒至数分钟）、多功能（检测分子浓度、大小和相互作用）等优点，因此有潜力成为一种均相荧光免疫检验新方法。FCS的临床应用还需极大地提高在单位时间内检测到的信号光子数并降低检测体积内的背景信号干扰；前者可通过等离子体纳米光学（PNP）器件的应用来实现，后者则需要在整合时间分辨荧光光谱（TRFS）和FCS技术基础上，开发统计学过滤（SF）方法来去除实验数据中的背景信号。本项目将首先进行荧光自相关和交相关技术分别应用于心衰标记物NT-proBNP和心梗标记物cTnI在溶液样品中均相、高敏（1-10pM）检测的原理性实验，并验证PNP器件在上述实验中的荧光信号增强效应。其次，我们将验证SF方法去除血清样品中干扰信号的有效性。最后，研究团队将研制一款基于TRFS-FCS整合技术的即时检验（POCT）样机，并示范对血清样品心脏标记物的均相、高敏检测。

医疗检测的难点是在生理样品（血浆等）中无需检测物分离（均相）、超灵敏检测疾病标志物。荧光寿命相关光谱（FLCS）在时间相关单光子计数（TCSPC）基础上整合荧光相关光谱（FCS）和时间分辨荧光光谱（TRFS）技术，通过统计学过滤（SF）方法有效分离具相似荧光发射光谱、但不同荧光寿命（荧光寿命差别大于10%）的荧光组份。本项目基于FLCS方法，开发了一种针对心衰标记物sST2的免疫荧光均相检测新技术。该技术可在微量（10微升）血浆中有效去除背景信号（内源荧光等）干扰，检测低至53pM的荧光标记短链ST2（Alexa488-tST2）。应用Alexa488-tST2和竞争法，FLCS方法可在一滴血中定量检测约400pM的心衰标记物fST2，低于该标记物在人体中的警戒值（1nM）。本研究验证了FLCS技术在医疗检测领域中的潜在应用价值。.FLCS方法还可研究生物分子的动态结构机制。经荧光共振能量转移（FRET）标记的生物分子，其不同构象体现于不同供体分子的荧光寿命。通过SF方法，FLCS可区分对应不同荧光寿命的荧光信号组份。对这些荧光信号组份进行FCS分析可检测构象之间的转换速率。本项目首先应用FRET标记的标准DNA发卡分子验证了以上技术。DNA发卡在不同盐（NaCl）浓度溶液中有三种构象：开放（O）、中间（I）、闭合（C）。应用最大熵值法（MEM)，可精确分析与这三种构象对应的供体分子（Alexa488）荧光寿命。FLCS方法检测了C-I、C-O构象转换速率分别为约143和156微秒，而I-O转换速率小于10微秒。随后，MEM-FLCS方法被应用于研究G四联体DNA分子（Myc G4）的动态分子机制。G4在不同盐（KCl）浓度溶液中主要以O和C构象存在。随着盐浓度增长，构象转换速率变慢，在100mM KCl条件下达最低值（约4毫秒）,反应了逐步稳定的G4三维机构。本研究开发了一种可解析微秒-毫秒时间域动态分子机制的新方法。.本项目还应用FCS技术开发了定量检测抗原-抗体亲和力的实验方法，并综述了FCS技术在生物大分子液-液相分离领域中的研究应用。