三维微图案化超细纤维支架的构建及调控功能性组织的形成

静电纺聚合物纤维作为一类很有发展潜力的组织工程支架，申请者在材料组成、纤维及纤维膜结构、携载生物活性物质、促进组织修复等方面开展了系列研究。在此基础上，针对组织内细胞存在的拓扑结构、而目前组织工程支架难于模拟细胞的生理微环境等现状，本项目拟构建三维微图案化的超细纤维支架。将光刻、软刻蚀技术同静电纺丝技术结合起来，电纺纤维规律性地沉积到微图案化的导电收集模板区域，获得微图案化纤维膜；进而基于快速成型的设计理念，以特定空间结构（血管）和多细胞空间分布（肝组织）为对象，紧密结合组织的解剖学特点，分别研究纤维膜层层叠加、逐一沉积等两种三维化方式，实现纤维支架内体相分布微图案化区域或空间。系统探讨支架的微图案特征、微图案区域的纤维特征，对细胞行为及其分泌细胞外基质的排列和空间分布的影响机制，更全面地掌握调控细胞行为及分布、功能性组织形成的机制和手段，为构造组织工程支架提供新的思路和方法。

针对目前组织工程支架难于模拟细胞的生理微环境等现状，本项目构建了三维微图案化的超细纤维支架，研究支架的生化环境和拓扑结构对细胞生长和组织形成的影响机制。参照项目计划书，完成了预定内容，达到了预期目标。完成研究任务要点如下：（1）利用微电子机械加工技术制备微图形掩膜、通过磁控溅射和光刻技术获得了微图案化导电模板，采用普通电纺装置制备微图案化纤维膜；系统考察了体系参数和图案特征对纤维膜的影响，进而通过图案化纤维膜层层叠加，构建成图案化纤维支架。（2）在纤维膜中构建细胞生长因子、表达生长因子质粒和中药的控释体系，系统考察蛋白生长因子的负载方式、质粒形成复合粒子的形式、中药配伍的协同作用等，可保护纤维中生长因子的结构完整性和生物活性，调节质粒转染效率和细胞毒性之间的平衡；基于纤维的结构和组成调控生化信号的释放行为，研究纤维特征、支架生化环境对细胞行为和组织形成的影响。（3）基于肝细胞在体外难于扩增、肝脏中多细胞共存协同作用的特点，在优化纤维支架促进肝细胞成球的基础上，构建了肝细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞的图案化共培养体系，结果表明促进了肝细胞的白蛋白和尿素分泌、P450表达和胆小管的形成，同时也促进了血管内皮细胞在三维图案化支架中的体相分布和毛细血管化的能力。（4）基于血管的层状解剖结构，分别制备平板和条状微图形化聚合物纤维膜，分别种植血管内皮细胞和平滑肌细胞，采用层层叠加的方式在接近细胞生理状态下实施共培养，结果表明与血管内皮细胞共培养，促进了平滑肌细胞细胞的增殖、细胞外基质分泌量和平滑肌细胞在纤维支架中的渗透；进一步在纤维中引入携载表达血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因的质粒，体外共培养3个月后获得了组织工程血管，生成血管的抗张强度和缝合强度均大于人体动脉血管，力学性能符合体内植入血管的要求。项目负责人作为通讯作者发表SCI论文23篇，其中18篇影响因子大于3；项目负责人作为第一申请人获得中国发明专利1项，申请2项。在项目执行期间，负责人2次参与组织国际国内学术会议、4次在国内外学术会议作邀请报告；参与项目的博士和硕士研究生中，2位博士生均获得首届国家奖学金、4位硕士生获得省校优秀学位论文。包含本项目研究的部分成果，“静电纺聚合物纤维的生物医用功能研究”获得2012年度教育部自然科学二等奖，项目负责人为第一完成人，是10篇代表作（共10篇）的通讯作者。