乙肝病毒x蛋白(HBx)调控microRNAs(miR-193b)的机制及其对乙肝相关肝癌肿瘤学特性影响的研究

Hepatitis B virus x protein(HBx) was proved to be a key factor in hepatocarcinogenesis process caused by HBV. Previous investigations suggested that inhibition of some tumor suppressor genes by HBx via inducing hypermethylation of CpG islands in the promoter region could be a crucial step in the development of hepatocellular carcinoma(HCC). In our previous study, HBx was shown to be able to up-regulate DNMTs and down-regulate some miRNAs,such as miR-193b, which could be restored after demethylation treatment in HepG2/HBx cell lines. And also, further research revealed that miR-193b is closely related with oncogenic activities of HCC and the prognosis of patients with liver cancer surgery. So we hypothesized that it is by inducing hypermethylation of promoter region that HBx regulated the expression of miRNAs. In the present study, we will take miR-193b as a key point to verify the hypothesis as stated above in HBx+/- cell lines and hepatocellular carcinoma tissues,explore its specific mechanism in vitro,and also we will find possible downstream targets of miR-193b ,such as Mcl-1, ZBTB5, c-Kit and so on, and research its effects on biological characteristics of hepatocarcinoma, that may help to elucidate the mechanism of hepatocarcinogenesis and provide new therapeutic targets for HBV-related HCC.

HBx蛋白是乙肝病毒致癌的重要因素，可通过诱导抑癌基因启动子区域高甲基化来抑制该基因表达。我们的前期研究发现HBx可上调DNA甲基转移酶家族（DNMTs）的表达，同时去甲基化处理后可恢复某些被HBx抑制的miRNAs表达，如miR-193b。进一步研究发现miR-193b与肝癌的肿瘤生物学特性有密切关系，且其表达水平与患者预后明显相关。因此，我们提出HBx通过DNA甲基化调控miRNAs表达而发挥其致癌作用的假设。本课题将先在肝癌细胞模型中以miR-193b为切入点，研究HBx是如何通过影响DNMTs调控microRNAs表达，并通过进一步研究miR-193b的功能，以揭示HBx调控miRNAs从而影响乙肝相关肝癌肿瘤学特性的机制，并在肝癌临床标本中加以回归验证。本研究有助于阐明HBx在肝癌中的作用，为寻找新的防治措施提供新的理论依据。

项目的背景：肝细胞肝癌是最常见的致死性肿瘤之一。乙肝病毒（HBV）感染是肝癌发生的高危因素，也是我国肝癌病例多发及预后较差的重要原因之一。HBV编码的x蛋白（HBx）是乙肝病毒致癌的重要因素，但具体机制尚未完全明确。研究表明HBx可以通过DNA甲基转移酶（DNMTs）诱导某些抑癌基因上游启动子过度甲基化，从而抑制抑癌基因的表达。我们发现稳定表达HBx的肝癌细胞系中miR-193b的表达下调，去甲基化处理后表达恢复；且miR-193b的表达与肝癌术后患者的预后呈正相关。因此我们提出HBx通过DNA甲基化调控miRNAs表达而发挥其致癌作用的假设，并以miR-193b为切入点，绘制由HBx→DNMTs→miRNAs→下游靶基因的调控网络，阐明乙肝病毒相关性肝癌发生发展的机制。.然而在项目的实施过程中，我们发现有文献对于乙肝相关肝癌中HBx→DNMTs→miRNAs→下游靶基因调控网络进行了研究报道，包括HBx通过DNMTs下调抑癌基因miR-205、miR-101等。我们提出的HBx通过DNA甲基化调控miRNAs表达而发挥其致癌作用的假设已得到证实。因此，我们决定调整研究方向，进行乙肝病毒相关肝癌中索拉菲尼耐药机制的相关研究。.主要研究内容、重要结果及关键数据：我们发现与HBV阴性肝癌细胞系相比，HBV阳性肝癌细胞系对索拉菲尼的耐药性提高；miR-193b在HBV阳性肝癌细胞系及组织中的表达比HBV阴性细胞系及组织中表达下调；过表达miR-193b能通过下调抗凋亡蛋白Mcl-1表达促进索拉菲尼介导的肝癌细胞凋亡。由此，我们证实在乙肝相关肝癌中HBV可通过下调miR-193b激活抗凋亡蛋白Mcl-1表达，导致肝癌细胞对于索拉菲尼的耐药性提高。相关研究结果已发表于Cancer Letters杂志上。.科学意义：对于无法手术或已经远处转移的肝癌患者，索拉菲尼是目前的一线治疗药物。然而在索拉菲尼的临床应用中，出现了获得性耐药的现象，尤其是在乙肝病毒相关性肝细胞肝癌中，其耐药机制目前仍未清楚。我们研究发现HBV感染可通过调控miR-193b及其下游靶蛋白Mcl-1促进肝癌细胞对于索拉菲尼的耐药；过表达miR-193b能够促进索拉菲尼介导的肝癌细胞凋亡，改善耐药现象。这一研究揭示了乙肝相关肝癌中索拉菲尼耐药产生的机制，为临床上改善乙肝相关肝癌索拉菲尼耐药提供了可能的潜在作用靶点。